思路2 研究甲基化修饰差异基因 第一步:直接进行m6A-seq和转录组测序,找到时间顺序或差异表达的基因并用qPCR、 WB等⽅法验证,此外找到m6A有差异的基因; 第二步:对甲基化酶进行敲低和过表达,检测RNA整体的m6A水平,之后可进行转录组或小RNA测序等方法检验甲基化酶敲低和过表达对mRNA或miRNA整体的影响,并着重研究第⼀步中感兴趣的m6A有差异的靶基因; 第三步:对靶基因进行敲低或过表达,是否能够对甲基化酶异常表达后的表型进⾏恢复; 第四步:对靶基因上motif进行点突变后进⼀步确认直接受到甲基化酶调控; 第五步:鉴定新型的甲基化酶(可选)。 当然根据不同的研究目的还有许多其他的研究思路,可根据自身实验设计进行延申和拓展。m6A相关SCI论文根据不同实验手段IF2~20不等,实验手段:m6A-seq、转录组测序/表达谱芯片、 LC-MS/MS 或 m6A 比色法、小RNA 测序/小RNA芯片、qPCR、 WB、敲降/过表达、靶基因验证、动物实验、临床实验/药物实验等。m6A 全转录组测序,m6A LncRNA测序。贵州m6A内容
已知tRNA上发生碱基修饰的比例较高,会有各种各样的碱基修饰行为。tRNA修饰有助于提高翻译效率,维持其三叶草折叠二级结构的稳定性。人类的核糖体RNA(rRNA)上有超过200个碱基修饰位点,而剪切体RNA(spliceosomal RNA)上也有超过50个碱基修饰位点。虽然RNA甲基化的研究在上世纪七十年代就开始,但是由于技术上的局限一直停滞不前。直到近几年在何川教授等研究团队的带领下,通过不断的技术创新和难点攻克,m6A 等甲基化修饰的研究才不断取得突破性的进展。云序生物聚焦于科研前沿领域,针对各类RNA分子、表观遗传学、蛋白质组学等研究热点为广大科研人员提供系统性解决方案。江苏m6A结果m6A修饰研究火热程度很高。
当出现热休克时,METTL3就会定位到染色质的热休克相关的基因上,m6A就会被添加到热休克转录本上,从而诱导这些转录本在应激压力下被清chu。UV诱导DNA破坏时,METTL3/14就会在2分钟内定位到UV诱导的损伤位点,同时伴随着m6A活动的增强。在人类多能干细胞的TGF-信号转录通路转导方面,活化的SMAD2/3会与METTL3/14-WTAP相互作用,诱导m6A添加到特定的转录本上。在AML细胞中,一部分METTL3会通过METTL14非依赖方式与CCAAT增强子结合蛋白zeta(CEBPZ)的启动子区域结合。在he心pG2细胞中,H3K36me3能通过与METTL14相互作用招募写入器,诱导mRNA的CDS和3'UTR上添加m6A。
RNA剪接后,成熟的mRNA必须从细胞核中输出以在细胞质中翻译或降解。研究者检测到STH处理的he心La细胞中细胞核mRNA的保留时间增加了40%,但是多聚腺苷酸化的RNA没有变化。在具有增强的m6A水平的ALKBH5缺陷型细胞中,通过5-溴尿苷(BrU)掺入分析观察到新生合成的RNA主要分布在细胞质中。据报道,不同的RNA种类通过核孔复合物利用不同的途径进行核输出。TAP-P15复合体是在衔接蛋白如ALY/REF衔接子、SR蛋白和TREX复合物的协助下用于mRNA输出。由于ASF/SF2的磷酸化水平决定其在剪接或核输出中的功能,因此推测由ALKBH5缺陷引起的ASF/SF2磷酸化减少将加强其与TAP/P15复合物的相互作用从而导致核mRNA输出加速。与mRNA不同,rRNA可以招募几种不同的途径使其出口更有效率。rRNA核出口可能不会受到ALKBH5缺陷的显着影响。有趣的是,ALKBH5缺陷也导致细胞质中SRPK1蛋白异常聚集。 SRPK1负责剪接因子的磷酸化,以促进其参与前mRNA的剪接。揭秘神经发育过程中m6A RNA甲基化与组蛋白修饰间的关系。
首先,作者发现了肺腺ai当中 m6A 去修饰化酶 FTO 的异常低表达,就此选定 FTO 这个酶为研究对象。紧接着,作者敲降 FTO 以控制变量,以研究 FTO 这个酶在肺腺ai中所发挥的功能。下一步,作者从上游和下游两个方向筛选出与 FTO 基因或 FTO蛋白发生互作的分子:一方面,通过一系列 Co-IP、ChIP 和荧光素酶报告实验,作者证明 FTO 基因是 Wnt 信号通路的靶基因,Wnt 诱导的 EZH2/β-catenin/LEF/TCF 复合体结合于 FTO 基因启动子区域的 TBE 元件区域,通过组蛋白 H3K27me 的甲基化抑制了 FTO 基因的转录;另一方面,通过 m6A MeRIP-seq 和生信预测,作者筛选出 MYC 作为 FTO 蛋白的靶基因,并通过一系列的 MeRIP-qPCR、RIP 和荧光素酶报告实验,证明 c-Myc 蛋白的表达量是跟随 FTO 蛋白表达量变化的因变量。肺腺ai当中m6A去修饰化酶FTO的异常低表达。天津云序生物m6A
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细胞RNA会天然地经历各种化学修饰。这些经化学修饰的核苷酸又赋予了其自身结构的多样性,从而在各种有序的代谢与机体的功能方面发挥着各种调控功能,进而影响了基因的表达。随着对回贴(mapping)位点修饰的全转录组测序方法的发展,对精确修饰进行检测和定量的高灵敏质谱方法的进步,以及参与修饰的“效应器”(effectors,包括各种能改变各种修饰位点的酶,例如写入器(writers)和擦除器(erasers)和能识别化学修饰位点的读取器(readers))理解的加深,近几年有关RNA修饰的研究呈现暴发式地增长。然而由于RNA种类庞杂,表达水平有差异,因此这给RNA修饰的研究带来了很大的挑战,另外,RNA的修饰还与细胞类型,组织特异性,以及修饰效应器的定位有关,这又增加了研究难度。我们在这篇综述里,重点阐述了近几年关于-甲基化转换酶(m6A,)功能的研究进展,强调了环境(context)对RNA修饰调控和功能的重要性。贵州m6A内容
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