指示剂是如何负载细胞,目前有三种在神经元上填充钙离子指示剂的方法,且都可以用于体内和体外研究。第一种方法是利用玻璃吸管将膜渗透性盐或葡聚糖形式的指示剂注入单个神经元中。此方法方便实验者控制单个神经元内的钙离子指示剂浓度且信噪比较高。第二种是利用“批量加载”的方法将钙离子指示剂染料负载神经元,观察对象为一群神经元。尽管此方法可能导致一些胶质细胞也被指示剂所标记,但明显提高了整体神经元的标记百分比,使研究者得以观察到一群神经元内动作电位相关性的活动。第三种也较为常用,通过病毒转染的方式使其基因编码钙离子指示剂。(A)单细胞注射法;(B)networkloading法;(C)通过病毒转染使其基因编码钙离子指示剂(expressionofgeneticallyencodedcalciumindicators,GECI)上海双光子显微镜就找因斯蔻浦。bruker双光子显微镜光子跃迁
相比普通的显微镜电子显微镜可以观察尺度更小的东西,冷冻电镜更是可以观察有活性的生物大分子,而双光子显微镜有什么优势呢?它能做到什么普通光学显微镜做不到的事情吗?原来,双光子显微镜可以精确穿透较厚标本进行定点、***观察!由于电磁波的波长越短,粒子性越强,受散射影响也就越大。双光子显微镜将激发光源改为长波长激光,在增加了激光的穿透性的同时还减少了对细胞的毒性。除此之外,因为只有物镜焦点处能发生双光子激发效应,所以扫描的精确度极高,也能提高激发光效率,减少被扫描点之外的荧光物质消耗。国外荧光双光子显微镜分辨率是多少双光子显微镜在各领域研究中已有许多成功实例;
临研所、病理科和科研处邀请北京大学王爱民副教授在2020年12月22日做了题目为“新一代微型双光子显微成像系统介绍及其在临床医疗诊断”的学术报告。学术报告由临研所医学实验研究平台潘琳老师主持。王爱民,北京大学信息科学技术学院副教授,毕业于北京大学物理系,获学士、硕士学位,后于英国巴斯大学物理系获博士学位。该研究组研发的微型双光子显微镜,第1次在国际上获得了小鼠大脑神经元和神经突触清晰稳定的动态信号,该成果获得了2017年度“中国光学进展”和“中国科学进展”,并被Nature Methods评为2018年度“年度方法--无限制行为动物成像”。目前,该研究组正在研究新一代双光子显微成像技术在临床诊断中的应用,为未来即时病理、离体组织检测、术中诊断等提供新的影像手段和分析方法。
WinfriedDenk较初使用的光源是染料飞秒激光器(100fs脉宽、630nm可见光波长)。虽然染料激光器对于实验室演示尚可,但是使用很不方便所以远未实现商用。很快双光子显微镜的标配光源就变成了飞秒钛宝石激光器。除了固态光源优势,钛宝石激光器还具有较宽的近红外波长调谐范围,而近红外相比可见光穿透更深,对生物样品损伤更小。下图是Thorlabs的双光子和三光子显微镜配置,钛宝石飞秒可调谐激光器位于平台较左边。从双光子到三光子科学家正在从双光子转向三光子显微镜。1996年,ChrisXu在康奈尔大学(Denk同导师实验室)读博期间发明了三光子显微镜,如果双光子吸收可行,那么三光子看起来也是自然的发展方向。三光子成像使用更长的波长,大约在1.3和1.7微米,其成像深度也比双光子更深,目前记录约为2.2毫米,人类大脑皮层厚约4毫米。相比双光子显微镜,三光子还要求以较低重频使用更强和更短的激光脉冲,而传统的钛宝石激光器难以达到这些要求,但是对于掺镱光纤飞秒光参量放大器则非常容易,比如我们的Y-Fi光参量放大器(OPA)。双光子显微镜为什么穿透能力强?
Denk很快就将双光子显微镜用于神经元成像,而1997年在Svoboda测量完整老鼠大脑的锥体神经元的感官刺激诱导树突钙离子动态后,双光子显微镜的潜能开始完全凸显。值得一提的是,霍华德·休斯医学院Svoboda实验室和Thorlabs在2016年合作推出了一种强大的多光子介观显微镜,其成像视场达到5毫米,能够跨多个脑区进行高速功能成像。根据清华大学单一采购来源的**指导意见:这种显微镜的视场是普通双光子显微镜的10倍。30年来,双光子显微镜已成为较厚生物组织三维成像中不可或缺的工具。从双光子到三光子甚至四光子,这种非线性成像技术通常也被统称为多光子显微镜。下图统计了自1990年以来每年发表的多光子显微镜文章数量,发展速度可见一斑。双光子显微镜明日之星--FemtoFiber ultra 920 。国内布鲁克双光子显微镜多少钱
如果已经有了飞秒光,就可以几套双光子显微镜共享一台,只需分光即可。bruker双光子显微镜光子跃迁
目前,世界各国的脑科学研究如火如荼,中国的脑计划也即将启动。其中,关于全景式解析脑连接图谱和功能动态图谱的研究成为重点研究方向,而如何打破尺度壁垒,融合微观神经元和神经突触活动与大脑整体的信息处理和个体行为信息,是领域内亟待解决的一个关键挑战。2021年1月6日,由北京大学分子医学研究所牵头,联合北大信息科学技术学院电子学系、工学院以及中国人民******医学科学院等组成的跨学科团队,在NatureMethods在线发表题为“Miniaturetwo-photonmicroscopyforenlargedfield-of-view,multi-plane,andlong-termbrainimaging”的文章。文中报道了第二代微型化双光子荧光显微镜FHIRM-TPM2.0,其成像视野是该团队于2017年发布的低1代微型化显微镜的7.8倍,同时具备三维成像能力,获取了小鼠在自由运动行为中大脑三维区域内上千个神经元清晰稳定的动态功能图像,并且实现了针对同一批神经元长达一个月的追踪记录。bruker双光子显微镜光子跃迁