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m6A研究思路 思路1 老数据挖掘 第一步:先从原有的转录组数据中,挖掘到差异表达的甲基化酶; 第二步:对挖掘到的甲基化酶如METTL3或FTO等进⾏qPCR验证,并进行m6A-seq分析哪些基因甲基化水平发生改变; 第三步:在细胞(动物模型可选)中对这些酶进行敲低和过表达,进行常规的qPCR和WB检测相关酶表达情况,并用LC-MS/MS法检测RNA整体m6A水平; 第四步:继续对这些敲低和过表达的细胞进行转录组测序/小RNA测序或表达谱芯片/小RNA芯片,分析哪些基因出现差异表达变化和可变剪切变化; 第五步:找到甲基化酶调控的靶基因,进行敲低和过表达,看甲基化酶缺陷的细胞或动物模型表型能否补救; 第六步:在确定上一步靶基因确实受到甲基化酶调控后,对靶基因上的motif进行点突变后进行验证; 第七步:鉴定新型的甲基化酶(可选)。m6a甲基化测序,云序生物为您提供服务。天津m6A文章

那么,Wnt 信号通路到底是怎么抑制 FTO 启动子的呢?作者通过 ChIP 实验发现,FTO 基因启动子区域的 TBE 元件区域附近的组蛋白存在 H3K27me3 的甲基化修饰现象。学界在先前的研究中已经知晓,EZH2 是一种负责组蛋白 H3K27me3 甲基化修饰的酶。通过Co-IP 实验发现,Wnt 刺激可以促进 EZH2 与 β-catenin 的结合;通过 ChIP 实验发现,Wnt 刺激也可以促进 EZH2 与 TBE 元件的结合。并且,敲降 EZH2 可阻断 Wnt 对 FTO 表达的抑制作用。综合前面的几个发现可以证明:Wnt 信号诱导了 EZH2 与 β-catenin 的结合,导致了 FTO 启动子附近的组蛋白发生 H3K27me3 甲基化修饰,从而抑制 FTO 表达。贵州研究m6Am6A修饰研究火热程度很高。

检测m6A的方法非常多,如包括MeRIPseq、 miCLIP-seq、 SCARLET、 LC-MS/MS等。2012年之后,两篇发表于Nature和Cell上的论⽂可以说是di⼀次从转录水平上,大范围高通量地鉴定了人和小鼠m6A的甲基化水平(Dominissini 2012和Meyer 2012)。这两篇独li发表的论文采用的he心方法就是将m6A抗体与带有m6A的mRNA的片段相结合后进行高通量测序。通过对下机数据的分析,来鉴定mRNA上m6A程度较高的区域,分辨率约为100nt。这种方法我们称之为MeRIP-seq(methylated RNA immunoprecipitation sequencing)或m6A-seq。

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那么,c-Myc 蛋白的表达水平又是如何受到调控的呢?作者设计了荧光素酶报告基因,将荧光素酶报告基因插入 MYC 的 mRNA 中,并将实验组的 mRNA 3’ 端的 m6A 突变为其它碱基,对照组的 MYC mRNA 则不做任何碱基修饰。结果发现,FTO 敲降后,对照组的 MYC mRNA 表达了大量荧光素酶,但经过碱基突变而不再具有 m6A 的实验组则没有荧光素酶信号,说明 MYC 的 mRNA 3’ 端的 m6A 对于蛋白的成功翻译不可或缺。相反地,如果过表达 FTO,那么肺腺ai细胞系的 c-Myc 蛋白的表达量会下降。但是,无论是 FTO 敲降还是过表达,MYC 的 mRNA 水平都没有改变。综上可知,c-Myc 蛋白表达量的变化,与 MYC mRNA 的 m6A 修饰水平正相关,而与 MYC mRNA 的表达水平无关。对m6A RNA流行检测手段为MeRIP-Seq技术。北京m6A平台

m6A试剂盒采用高盐/低盐缓冲液连续洗脱的流程可以大幅降低背景噪音。天津m6A文章

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