多束扫描技术可以同时对神经元组织的不同位置进行成像该技术：对两个远距离（相距大于1-2 mm）的成像部位，通常使用两条单独的路径进行成像；对于相邻区域，通常使用单个物镜的多光束进行成像。多光束扫描技术必须特别注意激发光束之间的串扰问题，这个问题可以通过事后光源分离方法或时空复用方法来解决。事后光源分离方法指的是用算法来分离光束消除串扰；时空复用方法指的是同时使用多个激发光束，每个光束的脉冲在时间上延迟，这样就可以暂时分离被不同光束激发的单个荧光信号。引入越多路光束就可以对越多的神经元进行成像，但是多路光束会导致荧光衰减时间的重叠增加，从而限制了区分信号源的能力；并且多路复用对电子设备的工作速率有很高的要求；大量的光束也需要更高的激光功率来维持近似单光束的信噪比，这会容易导致组织损伤。多光子显微镜涉及医学、生物学、化学、物理学、电子学、工程学等学科，生产工艺相对复杂，进入门槛较高。美国布鲁克多光子显微镜Ultima Investigator
多光子显微优点：☆光损伤小：由于双光子显微镜使用的是可见光或近红外光作为激发光源，这一波段的光对细胞和组织的光损伤小，适用于长时间的研究；☆穿透能力强：相对于紫外光，可见光和近红外光都具有更强的穿透能力，因而受生物组织散射的影响更小，解决对生物组织中深层物质的层析成像研究问题；☆高分辨率：由于双光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的区域内可以激发出荧光，双光子吸收*局限于焦点处的体积约为波长3次方的范围内；☆漂白区域小：由于激发只存在于交点处，所以焦点以外的区域都不会发生光漂白现象；☆荧光收集率高：与共聚焦成像相比，双光子成像不需要光学滤波器，这样就提高了对荧光的收集率，而收集率的提高直接导致图像对比度的提高；☆图像对比度高：由于荧光波长小于入射波长，因而瑞利散射产生的背景噪声只有单光子激发时的1/16，降低了散射的干扰；☆光子跃迁具有很强的选择激发性，所以可以对生物组织中一些特殊物质进行成像研究；☆避免组织自发荧光的干扰，获得较强的样品荧光：生物组织中的自发荧光物质的激发波长一般在350~560nm范围内，采用近红外或红外波段的激光作为光源，能**降低生物组织对激发光吸收。 美国啮齿类多光子显微镜Ultima 2P Plus全球多光子显微镜主要消费地区分析，包括消费量及份额等。
基于多光子显微镜的神经成像技术原理：多光子显微镜可用于深度成像和三维成像，因此可用于拍摄不透明的厚样品。目前主要使用的多光子显微镜包括双光子显微镜和三光子显微镜。双光子显微镜的结构与共焦类似，区别在于：1)双光子显微镜的激发光波长比共焦长，能量较低，但穿透能力较强；2)双光子显微镜没有小孔，提高了检测效率；3)双光子显微镜成像深度较快提高。那么，为什么双光子能具有共焦显微镜所没有的优势呢？原因是它采用双光子激发方式。使用波长较长的激发光子，光子的能量较低，因此电子需要吸收两个这样的激发光子才能达到激发态，从而释放出一个荧光光子。因此，荧光信号的强度与光强的平方成正比。因为焦点处的光强较大，只能在焦点处激发荧光。波长越长，穿透力越强，因此双光子显微镜的成像深度大于共焦显微镜。由于两个光子只在焦点激发荧光，不需要小孔，而是将所有的荧光都收集起来，提高了检测效率。三光子显微镜的原理类似于双光子显微镜，利用三个激发光子可以实现更深的成像深度。由于使用了更长的激发波长，穿透能力更强，成像深度更大。此外，由于较强的非线性效应，荧光信号的强度与光强的立方成正比，因此比双光子具有更低的非聚焦激发和背景噪声。
多光子激发的特点。激发波长∶两个或多个光子同时激发，激发波长是单光子激发波长的两倍或多倍（i.e.红光能激发UV探针）。多光子激发∶依赖于多个光子同时到达的时间。使用脉冲飞秒激光器（i.e.10-16 seconds），且能提供更高的峰值功率。荧光限制在焦点处，能满足多个光子同时达到产生多光子吸收。荧光强度正比于（激光强度）n。为什么使用飞秒激光器?多光子激发需要超快的激光器，皮秒脉冲不能实现三光子激发。深度成像需要更高、更窄脉冲输出功率。多光子激发光源处于近红外区，对细胞毒性和光漂白更小。多光子显微镜的发展现状及未来发展趋势。
双光子显微镜工作原理是将超快的红外激光脉冲传输到样品中，在样品中与组织或荧光标记相互作用，这些组织或荧光标记发出用于创建图像的信号。双光子显微镜被多用于生物学研究，因为它能够产生高分辨率的3-D图像，深度达1毫米。然而，这些优点带来了有限的成像速度，因为微光条件需要逐点图像采集和重建的点检测器。为了加快成像速度，科学家之前开发了一种多焦点激光照明方法，该方法使用数字微镜设备(DMD)，这是一种通常用于投影仪的低成本光扫描仪。此前人们认为这些DMD不能与超快激光一起工作。然而现在解决了这个问题，这使得DMD在超快激光应用中得以应用，这些应用包括光束整形、脉冲整形、快速扫描和双光子成像。DMD在样品内随机选择的位置上产生5到30点聚焦激光。 多光子成像是一种非线性的过程，信号产生要求功率密度达到MW/cm2的量级。模块化多光子显微镜系统
多光子显微镜可以更好的了解神经信号之间复杂动态的编码过程。美国布鲁克多光子显微镜Ultima Investigator
要想实现离散的轴向重新聚焦，需要在OBJ1的焦平面中放置一个阶梯镜（图3b）。当入射激光束被OBJ1聚焦到的焦平面恰好与阶梯重合时，被反射的激光将在无穷大的空间中成为准直光束，并在OBJ2的焦平面上形成激光光斑。并且返回的激光束会被GSM消除横向扫描，即OBJ2形成的焦点不会进行横向扫描，实现轴向扫描。如果激光点被扫描到与焦平面不一致的阶梯，则会形成远离镜面的激光焦点，返回的激光束会在无穷大的空间中会聚或发散，进而导致由OBJ2形成的激光焦点也在轴向重新聚焦，通过这种方式即能实现离散的轴向扫描。对于已精确匹配两个物镜光瞳的光学装置，不会引入像差。为了进行连续的轴向重新聚焦，将阶梯镜替换为稍微倾斜的平面镜，同时入射的激光焦点也需要被倾斜，使得其以垂直于镜面的方向入射，通过相对入射激光束稍微平移OBJ1即可实现这种倾斜。美国布鲁克多光子显微镜Ultima Investigator
