近来关于m6A甲基化的研究,热度持续不减。早在2015年就已经在《Nature》和《Cell》上发表了相关研究。那么下面我们就来了解一下这期的主角——m6A甲基化。已知RNA存在超过100种修饰。在真核生物中,5’端的Cap以及3’的ployA修饰在转录调控中起到了十分重要的作用,而mRNA的内部修饰则用于维持mRNA的稳定性。mRNA较常见的内部修饰包括N6-腺苷酸甲基化(m6A)、N1-腺苷酸甲基化(m1A)、胞嘧啶羟基化(m5C)等。对于大热的m6A,截至2017年,全球的科学家已经鉴定了参与m6A的许多酶,包括去甲基化酶、甲基化酶和甲基化识别酶等。芝加哥大学的何川教授对此贡献巨大。来自中科院北京基因组研究所的杨运桂研究员也是这方面的大牛。赫捷院士团队揭密肺腺ai m6A 机制。杭州分析m6A
一旦参与m6A修饰的酶出现异常将会引起一系列疾病,包括tumour、神经性疾病、胚胎发育迟缓等。此外,一些非编码RNA如lncRNA、tRNA、rRNA以及剪切体RNA在转录前后,也存在大量的碱基修饰活动。虽然近几年,关于RNA修饰的研究数量开始增多并慢慢成形,一些深入性的机制研究仍有大量的工作待全球的科学家去完成。但是无论如何,coding RNAs和non-coding RNAs上发生的动态修饰dai表了一种全新的遗传信息调控方式。云序生物聚焦于科研前沿领域,针对各类RNA分子、表观遗传学、蛋白质组学等研究热点为广大科研人员提供系统性解决方案。云序m6A分析m6A除了分布在 mRNA 中,也出现在很多非编码 RNA中。
RNA剪接后,成熟的mRNA必须从细胞核中输出以在细胞质中翻译或降解。研究者检测到STH处理的he心La细胞中细胞核mRNA的保留时间增加了40%,但是多聚腺苷酸化的RNA没有变化。在具有增强的m6A水平的ALKBH5缺陷型细胞中,通过5-溴尿苷(BrU)掺入分析观察到新生合成的RNA主要分布在细胞质中。据报道,不同的RNA种类通过核孔复合物利用不同的途径进行核输出。TAP-P15复合体是在衔接蛋白如ALY/REF衔接子、SR蛋白和TREX复合物的协助下用于mRNA输出。由于ASF/SF2的磷酸化水平决定其在剪接或核输出中的功能,因此推测由ALKBH5缺陷引起的ASF/SF2磷酸化减少将加强其与TAP/P15复合物的相互作用从而导致核mRNA输出加速。与mRNA不同,rRNA可以招募几种不同的途径使其出口更有效率。rRNA核出口可能不会受到ALKBH5缺陷的显着影响。有趣的是,ALKBH5缺陷也导致细胞质中SRPK1蛋白异常聚集。 SRPK1负责剪接因子的磷酸化,以促进其参与前mRNA的剪接。
思路2 研究甲基化修饰差异基因 第一步:直接进行m6A-seq和转录组测序,找到时间顺序或差异表达的基因并用qPCR、 WB等⽅法验证,此外找到m6A有差异的基因; 第二步:对甲基化酶进行敲低和过表达,检测RNA整体的m6A水平,之后可进行转录组或小RNA测序等方法检验甲基化酶敲低和过表达对mRNA或miRNA整体的影响,并着重研究第⼀步中感兴趣的m6A有差异的靶基因; 第三步:对靶基因进行敲低或过表达,是否能够对甲基化酶异常表达后的表型进⾏恢复; 第四步:对靶基因上motif进行点突变后进⼀步确认直接受到甲基化酶调控; 第五步:鉴定新型的甲基化酶(可选)。 当然根据不同的研究目的还有许多其他的研究思路,可根据自身实验设计进行延申和拓展。m6A相关SCI论文根据不同实验手段IF2~20不等,实验手段:m6A-seq、转录组测序/表达谱芯片、 LC-MS/MS 或 m6A 比色法、小RNA 测序/小RNA芯片、qPCR、 WB、敲降/过表达、靶基因验证、动物实验、临床实验/药物实验等。m6A RNA-seq的富集效率是决定数据质量的关键。
肺腺ai细胞中的 FTO 的表达是因为什么原因而下调的呢?为了回答这个问题,作者用 PROMO 软件分析 FTO 基因的启动子序列,在其中找到了 3 个有可能是 TBE 元件(LEF/TCF-binding element)的区域。为了验证生信预测的真实性,作者又进行了了一系列分子生物学实验。首先,ChIP 实验证实了 TCF4 与 FTO 启动子的结合。另外,荧光素酶报告基因的结果显示,β-catenin 也可通过结合前述的 3 个 TBE 元件来抑制 FTO 启动子。因此,β-catenin/LEF/TCF 复合体被证明可以抑制 FTO 启动子的活性。人类肺腺ai细胞系经过 Wnt 处理后,FTO 的 mRNA 和蛋白表达水平均有所降低,并且这种现象可通过敲降 β-catenin 来逆转。综合前面的几个发现可以证明:Wnt 在信号通路的上游,通过诱导 β-catenin,使得β-catenin/LEF/TCF 复合体结合到 FTO 启动子上,终抑制了 FTO 的表达。YTHDF1 通过结合 m6A 修饰的 MYC mRNA 来促进其翻译。吉林m6Apri-miRNA测序
近年来,科学家们发现了一种可逆的RNA甲基化—m6A。杭州分析m6A
m6A研究思路 思路1 老数据挖掘 第一步:先从原有的转录组数据中,挖掘到差异表达的甲基化酶; 第二步:对挖掘到的甲基化酶如METTL3或FTO等进⾏qPCR验证,并进行m6A-seq分析哪些基因甲基化水平发生改变; 第三步:在细胞(动物模型可选)中对这些酶进行敲低和过表达,进行常规的qPCR和WB检测相关酶表达情况,并用LC-MS/MS法检测RNA整体m6A水平; 第四步:继续对这些敲低和过表达的细胞进行转录组测序/小RNA测序或表达谱芯片/小RNA芯片,分析哪些基因出现差异表达变化和可变剪切变化; 第五步:找到甲基化酶调控的靶基因,进行敲低和过表达,看甲基化酶缺陷的细胞或动物模型表型能否补救; 第六步:在确定上一步靶基因确实受到甲基化酶调控后,对靶基因上的motif进行点突变后进行验证; 第七步:鉴定新型的甲基化酶(可选)。杭州分析m6A
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