离子通道是一种特殊的膜蛋白,它横跨整个膜结构,是细胞内部与部外联系的桥梁和细胞内外物质交换的孔道,当通道开放时。细胞内外的一些无机离子如Na,k Ca 等带电离子可经通道顺浓度梯度或电位梯度进行跨膜扩散,从而形成这些带电离子在膜内外的不同分布态势,这种态势和在不同状态下的动态变化是可兴奋细胞静息电位和动作电的基础。这些无机离子通过离子通道的进围所产生的电活动是生命活动的基础,只有在此基础上才可能有腺体分泌、肌肉收缩、基因表达、新陈代谢等生命活动。离子通道结构和功能障碍决定了许多疾病的发生和发展。因此,了解离子通道的结构、功能以及结构与功能的关系对于从分子水平深入探讨某些疾病的病理生理机制、发现特异药物或措施等均具有十分重要的理论和实际意义。Neher创膜片钳的膜电容检测与碳纤电极电化学检测联合运用的技术。高通量全自动膜片钳技术
把膜电位钳位电压调到-80--100mV,再用钳位放大器的控制键把全细胞瞬态充电电流调定至零位(EPC-10的控制键称为C-slow和C-series;Axopatch200标为全细胞电容和系列电阻)。写下细胞的电容值Cc和未补整的系列电阻值Rs,用于消除全细胞瞬态电流,计算钳位的固定时间(即RsCc),然启根据欧姆定律从测定脉冲电流的振幅算出细胞的电阻RC。缓慢调节Rs旋钮注意测定脉冲反应的变化,逐渐增加补整的比例。如果RS补整非常接近振荡的阈值,RS或Cc的微细变化都会达到震荡的阈值,产生电压的振荡而使细胞受损。因此应当在RS补整水平写不稳定阈值之间留有10%-20%的余地为安全。准备资料收集和脉冲序列的测定。芬兰高通量全自动膜片钳技术一些学者建立了组织切 片膜片钳技术(Slice patch),就能在哺乳动物脑片制备上做全细胞记录。
膜片钳技术的发展∶全自动膜片钳技术(Automated patch clamp technique)的出现标志着膜片钳技术已经发展到了一个崭新阶段,从这个意义上说,前面所讲的膜片钳技术我们称之为传统膜片钳技术( Traditional patch clamp technique),传统膜片钳技术每次只能记录一个细胞(或一对细胞),对实验人员来说是一项耗时耗力的工作,不适合在药物开发初期和中期进行大量化合物的筛选,也不适合需要记录火量细胞的基础实验研究。全自动膜片钳技术的出现在很大程度上解决了这些问题,它不仅通量高,一次能记录几个甚至几十个细胞,而且从找细胞、形成封接、破膜等整个实验操作实现了自动化,免除了这些操作的复杂与困难。这两个优点使得膜片钳技术的工作效率提高了!全自动膜片钳技术采用的标本必须是悬浮细胞,像脑片这类标本无法采用。此外,全自动膜片钳技术只能进行全细胞记录模式、穿孔膜片钳记录模式以及细胞贴附式单通道记录模式,而不能进行其他模式的记录。
全细胞记录构型(whole-cell recording) 高阻封接形成后,继续以负压抽吸使电极管内细胞膜破裂,电极胞内液直接相通,而与浴槽液绝缘,这种形式称为“全细胞”记录。它既可记录膜电位又可记录膜电流。其中膜电位可在电流钳情况下记录,或将玻管连到标准高阻微电极放大器上记录。在电压钳条件下记录到的大细胞全细胞电流可达nA级,全细胞钳的串联电阻(玻管和细胞内部之间的电阻)应当补偿。任何流经膜的电流均流经这一电阻,所引起的电压降将使玻管电压不同于细胞内的真正电位。电流愈大,愈需对串联电阻进行补偿。全细胞钳应注意细胞必需合理的小到其电流能被放大器测到的范围(25~50 nA)。减少串联电阻的方法是玻管尖要比单通道记录大。膜片钳技术实现了小片膜的孤立和高阻封接的形成,增宽了记录频带范围,提高了分辨率。
膜片钳放大器是整个实验系统中的主要,它可用来作单通道或全细胞记录,其工作模式可以是电压钳,也可以是电流钳。从原理来说,膜片钳放大器的探头电路即I-V变换器有两种基本结构形式,即电阻反馈式和电容反馈式,前者是一种典型的结构,后者因用反馈电容取代了反馈电阻,降低了噪声,所以特别适合较低噪声的单通道记录。由于供膜片钳实验的专门的计算机硬件及相应的软件程序的相继出现,使得膜片钳实验操作简便、效率提高。如与EPC-9型膜片钳放大器(内含ITC-16数据采集/接口卡)配套使用的软件PULSE/PULSEFIT,它既可产生刺激波形,控制数据采集,又可分析数据,同时具有用于膜电容监测的锁相放大器,多种软件功能集成于一体。全细胞膜片钳记录是应用较早,也是普遍的钳位技术。日本多通道膜片钳电压钳制
封接是膜片钳记录的关键步骤之一。高通量全自动膜片钳技术
1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann在青蛙肌细胞上记录记录到ACh jihuo的单通道离子电流1980年Sigworth等用负压吸引,得到10-100GΩ的高阻封接(Giga-sea1),降低了记录时的噪声1981年Hamill和Neher等引进了膜片游离技术和全细胞记录技术1983年10月,《Single-ChannelRecording》一书问世,奠定了膜片钳技术的里程碑。膜片钳技术原理膜片钳技术是用玻璃微电极接触细胞,形成吉欧姆(GΩ)阻抗,使得与电极前列开口处相接的细胞膜的膜片与周围在电学上绝缘,在此基础上固定电位,对此膜片上的离子通道的离子电流(pA级)进行监测记录的方法。高通量全自动膜片钳技术
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