Denk很快就将双光子显微镜用于神经元成像,而1997年在Svoboda测量完整老鼠大脑的锥体神经元的感官刺激诱导树突钙离子动态后,双光子显微镜的潜能开始完全凸显。值得一提的是,霍华德·休斯医学院Svoboda实验室和Thorlabs在2016年合作推出了一种强大的多光子介观显微镜,其成像视场达到5毫米,能够跨多个脑区进行高速功能成像。根据清华大学单一采购来源的**指导意见:这种显微镜的视场是普通双光子显微镜的10倍。30年来,双光子显微镜已成为较厚生物组织三维成像中不可或缺的工具。从双光子到三光子甚至四光子,这种非线性成像技术通常也被统称为多光子显微镜。自1990年以来每年发表的多光子显微镜文章数量,发展速度可见一斑。双光子显微镜在组织透明化成像中应用;国外ultima2PPLUS双光子显微镜成像原理是什么
Winfried Denk较初使用的光源是染料飞秒激光器(100 fs脉宽、630 nm可见光波长)。虽然染料激光器对于实验室演示尚可,但是使用很不方便所以远未实现商用。很快双光子显微镜的标配光源就变成了飞秒钛宝石激光器。除了固态光源优势,钛宝石激光器还具有较宽的近红外波长调谐范围,而近红外相比可见光穿透更深,对生物样品损伤更小。下图是Thorlabs的双光子和三光子显微镜配置,钛宝石飞秒可调谐激光器位于平台较左边。从双光子到三光子科学家正在从双光子转向三光子显微镜。1996年,Chris Xu在康奈尔大学(Denk同导师实验室)读博期间发明了三光子显微镜,如果双光子吸收可行,那么三光子看起来也是自然的发展方向。
三光子成像使用更长的波长,大约在1.3和1.7微米,其成像深度也比双光子更深,目前记录约为2.2毫米,人类大脑皮层厚约4毫米。相比双光子显微镜,三光子还要求以较低重频使用更强和更短的激光脉冲,而传统的钛宝石激光器难以达到这些要求,但是对于掺镱光纤飞秒光参量放大器则非常容易,比如我们的Y-Fi光参量放大器(OPA)。 国外2PPLUS双光子显微镜的原理双光子显微镜放大倍数是多少?
随着技术的发展,双光子显微镜的性能得到不断地优化,结合它的特点,大致可以分成深和活两个方面的提升。要想让激发激光进入更深的层面,大致可从两个方面入手,装置优化与标本改造。关于装置优化,我们可以把激光束变得更细,使能量更加集中,就能让激光穿透更深。关于标本,其中影响光传播的主要是物质吸收和散射,解决这个问题,我们需要对样本进行透明化处理。一种方法是运用某种物质将标本浸泡,使其中的物质(主要是脂质)被破坏或溶解。另一种方法是运用电泳将脂质电解,让标本“透明度”提高。
双光子显微镜为什么穿透能力强?生物组织在近红外波段存在两个窗口,第1个近红外窗口对应波长在700nm-900nm,第2个近红外窗口对应波长在1000nm-1400nm之间。举例说明就是单晶硅对于可见光几乎是不透明的,但是对于红外波段就像是“水晶”一样通透性很好了。原因有两点:
1.生物组织对红外光的吸收弱,对可见光吸收强。类似的,平时用手电筒照射手指,会看到手通透红亮,也是由于生物组织对长波长的红光吸收少。
2.生物组织对红外光的散射弱。因为瑞利散射的强度反比于波长λ的四次方。类似的,早晨的太阳非常红,也就是因为长波长的红光穿透力更强。
这两点共同导致长波长的红外光比可见光对生物组织的穿透能力强。 双光子显微镜为什么穿透能力强?
双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。双光子激发的基本原理是:在高光子密度的情况下,荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子,在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后,发射出一个波长较短的光子;其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。
双(多)光子成像优势在于,具有更深的组织穿透深度,利用红外光,能够在层面检测极限达1mm的组织区域;因信号背景比高,而具有更高的对比度;因激发体积小,具有定点激发的特性,具有更少的光毒性;激发波长由紫外、可见光调整为红外激发,能够更加安全。 双光子显微镜厂家有哪些?国内荧光激光双光子显微镜光刺激
双光子显微镜还可以对一些具有双光子特性的染料细胞进行特定实验;国外ultima2PPLUS双光子显微镜成像原理是什么
高光子密度带来的高能量容易损伤细胞,所以双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,其脉冲达到最大值所持续的周期只有十万亿分之一秒,而其频率可以达到80至100兆赫,这样即能达到双光子激发的高光子密度要求,又能不损伤细胞,使扫描能更好地进行。双光子显微镜
在各领域研究中已有许多成功实例
生物领域:贝尔实验室的Svoboda等人研究了大脑皮层神经元细胞内钙离子动力学情形。利用双光子显微镜观察到的现象证明了钙离子的增加依赖于肌体触发的钠离子作用电势。信息领域:美国科学家Rentzepis提出了一种在现有二维光盘的基础上将数据储存扩展到三维空间。由于双光子激发具有作用精细体积小的特点,避免了层与层之间的互相干扰,极大地提高了数据储存密度。 国外ultima2PPLUS双光子显微镜成像原理是什么
因斯蔻浦(上海)生物科技有限公司致力于仪器仪表,是一家服务型公司。公司业务分为nVista,nVoke,3D bioplotte,invivo等,目前不断进行创新和服务改进,为客户提供良好的产品和服务。公司秉持诚信为本的经营理念,在仪器仪表深耕多年,以技术为先导,以自主产品为重点,发挥人才优势,打造仪器仪表良好品牌。在社会各界的鼎力支持下,持续创新,不断铸造***服务体验,为客户成功提供坚实有力的支持。