Denk很快就将双光子显微镜用于神经元成像，而1997年在Svoboda测量完整老鼠大脑的锥体神经元的感官刺激诱导树突钙离子动态后，双光子显微镜的潜能开始完全凸显。值得一提的是，霍华德·休斯医学院Svoboda实验室和Thorlabs在2016年合作推出了一种强大的多光子介观显微镜，其成像视场达到5毫米，能够跨多个脑区进行高速功能成像。根据清华大学单一采购来源的**指导意见：这种显微镜的视场是普通双光子显微镜的10倍。30年来，双光子显微镜已成为较厚***生物组织三维成像中不可或缺的工具。从双光子到三光子甚至四光子，这种非线性成像技术通常也被统称为多光子显微镜。下图统计了自1990年以来每年发表的多光子显微镜文章数量，发展速度可见一斑。双光子显微镜有哪些应用呢？进口激光双光子显微镜荧光寿命计数
双光子显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。
双（多）光子成像优势在于，具有更深的组织穿透深度，利用红外光，能够在层面检测极限达1mm的组织区域；因信号背景比高，而具有更高的对比度；因激发体积小，具有定点激发的特性，具有更少的光毒性；激发波长由紫外、可见光调整为红外激发，能够更加安全。 2PPLUS双光子显微镜厂家有哪些双光子显微镜品牌有哪些？
刚好双光子在这两点具有很大的优势在实际操作中成像的深度和样品的关系很大，
双光子成像利用高亮度的荧光标记材料，已经有做到mm级别的穿透深度
High quality cellular TP imaging with high signal-to-background ratio (> 100) and tissue imaging with a penetration depth of 2200 μm have been achieved with P-QD as probe.
Extremely High Brightness from Polymer-Encapsulated Quantum Dots for Two-photon Cellular and Deep-tissue Imaging : Scientific Reports : Nature Publishing Group
I try to explain why two-photon microscopy has a deeper imaging depth than one-photon microscopy, in the area of biomedical imaging. Many of the biomedical imaging modalities, no matter one-photon (confocal) or multi-photon (two-photon), use lasers as light source and require compatible fluorescent dyes.
Fluorescent dyes have their own excitation wavelength, and they can either be excited by a single photon with the photon energy of that excitation wavelength (E=hv=h*c/λ); or by two photons, arriving almost at the same time, but each with approximately half of the energy, hence of double wavelength than one-photon (0.5E->2λ). The former is the principle of one-photon microscopy and the latter is the principle of two-photon microscopy.
When imaging the same fluorescent dye, since two-photon could use approximately doubled wavelength compared with single-photon, two-photon can obviously penetrated deeper into the tissue due to less scattering (longer wavelength, less scattering). 双光子显微镜可以进行厚的组织样品拍摄；
双光子显微成像的在生物医学研究和医疗领域应用有较大的应用前景，首先双光子显微镜能够进行细胞和组织结构成像，在亚微米级成像，此功能与目前市场上的共聚焦类显微镜性能类似；双光子显微成像能够实时、在体、原位、无创地，根据不同物质组份的光谱特性，区分成像；双光子显微镜能够进行生化指标成像，在无造影剂的前提下，利用自发荧光、二次谐波、荧光获得活细胞生化信息。双光子显微镜技术在医疗诊断应用中具有巨大的潜力，该领域还未形成标准和体系，需要系统的医学研究与庞大的医疗数据加以支撑，通过研究人体基于多光子成像技术，进行细胞结构、生化成分、微环境、组织形态、代谢功能的影响信息，找到与疾病的细胞学、分子生物学、组织病理学、诊断和***特征的关联关系，共同探究生理病理基础和分子细胞生物学机制，筛选鉴定**、皮肤病、自身免疫病及其他疑难疾病的诊断及鉴别诊断依据，建立全新的多光子细胞诊断的完整数据库，定义出针对不同疾病的多光子临床检测设备的产品标准。这种双光子显微镜的视场是普通显微镜的10倍。ultima双光子显微镜成像视野是多少
成像平台倒置双光子显微镜启用显微镜自带调焦设备；进口激光双光子显微镜荧光寿命计数
Winfried Denk较初使用的光源是染料飞秒激光器(100 fs脉宽、630 nm可见光波长)。虽然染料激光器对于实验室演示尚可，但是使用很不方便所以远未实现商用。很快双光子显微镜的标配光源就变成了飞秒钛宝石激光器。除了固态光源优势，钛宝石激光器还具有较宽的近红外波长调谐范围，而近红外相比可见光穿透更深，对生物样品损伤更小。下图是Thorlabs的双光子和三光子显微镜配置，钛宝石飞秒可调谐激光器位于平台较左边。科学家正在从双光子转向三光子显微镜。1996年，Chris Xu在康奈尔大学(Denk同导师实验室)读博期间发明了三光子显微镜，如果双光子吸收可行，那么三光子看起来也是自然的发展方向。三光子成像使用更长的波长，大约在1.3和1.7微米，其成像深度也比双光子更深，目前记录约为2.2毫米，人类大脑皮层厚约4毫米。相比双光子显微镜，三光子还要求以较低重频使用更强和更短的激光脉冲，而传统的钛宝石激光器难以达到这些要求，但是对于掺镱光纤飞秒光参量放大器则非常容易，比如我们的Y-Fi光参量放大器(OPA)。进口激光双光子显微镜荧光寿命计数
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