使用双光子显微镜可以以亚细胞分辨率对钙离子传感器和谷氨酸传感器成像，从而测量不透明大脑深处的活动；成像膜电压变化能直接反映神经元活动，但神经元活动的速度对于常规的2PM来说太快。目前电压成像主要通过宽场显微镜实现，但它的空间分辨率较差并且只是于浅层深度。因此要在不透明的大脑中以高空间分辨率对膜电压变化进行成像，需要较提高2PM的成像速率。FACED模块输出处的子脉冲序列可以看作从虚拟光源阵列发出的光，这些子脉冲在中继到显微镜物镜后形成了一个空间上分离且时间延迟的焦点阵列。然后将该模块并入具有高速数据采集系统的标准双光子荧光显微镜中，如图2所示。光源是具有1MHz重复频率的920nm的激光器，通过FACED模块可产生80个脉冲焦点，其脉冲时间间隔为2ns。这些焦点是虚拟源的图像，虚拟源越远，物镜处的光束尺寸越大，焦点越小。光束沿y轴比x轴能更好地充满物镜，从而导致x轴的横向分辨率为0.82µm，y轴的横向分辨率为0.35µm。双光子显微镜在多个领域研究中已有许多成功实例。美国ultima2PPLUS双光子显微镜光子跃迁
TOPTICAFemtoFiberultra920超快光纤激光器是一种易于操作且无需维护的激光系统。其输出波长为920nm，非常适合常规荧光基团（如GFP，eGFP，Eosin，GCaMP，CFP，Calcein或者Venus）的双光子激发。能给荧光基团提供比较高的峰值功率，常用于神经科学和其他与激光有关的生物光子学学科。而且其独特设计（制造简单且经济高效的光源）对双光子荧光显微镜发展的革新具有潜在的可能。在双光子显微镜中，峰值功率就是亮度！如果您希望获得比较好的图像亮度，那么你就需要短脉冲，高功率，较重要的是需要干净的时间脉冲形状。FemtoFiberultra920具有足够高的输出功率，较短的脉冲和独特的Clean-Pulse技术，以及具有相对比较高的峰值功率，使得其在双光子显微镜中可以实现****的亮度，而不会对样品造成不必要的加热。FemtoFiberultra920交钥匙，完全集成的色散补偿（可确保样品处的脉冲较短），内置的功率控制，操作直观以及其坚固而紧凑的设计，使该系统具有极为友好的用户体验，是非线性显微镜应用的较好解决方案。例如荧光蛋白的双光子激发和基于SHG的对比机制。国内布鲁克双光子显微镜分辨率微型双光子显微镜的优势是。
共聚焦显微可以呈现这么漂亮的图像，是不是什么样品都可以用共聚焦显微镜拍拍拍.....得到各种各样清晰漂亮的图像呢？答案是否定的，任何事物都有优缺点，何况一台仪器呢，共聚焦显微镜也是有自己的局限,共聚焦有哪些局限呢：1.共聚焦显微镜只能拍摄约200um以内的的样品，对于厚的或者样品不能进拍摄；2.共聚焦显微镜由于是逐点进行扫描，对样品的光毒性还是比较大的，特别是拍摄活细胞样品时就更容易对样品进行淬灭；3.由于光照射的区域几乎能通过这个Z轴的层面，所以对于空间定点光刺激的实验定点位置就不是特别精确；并且激光共聚焦显微镜没有纯紫外进行激发，对于一些特殊激发波长的实验，效率非常低。
WinfriedDenk使用的第1个光源是染料飞秒激光(脉冲宽度100fs，可见光波长630nm)。染料激光虽然实验室演示可以接受，但是使用起来不方便，所以离商业化还很远。很快双光子显微镜的标准光源变成了飞秒钛宝石激光器。钛宝石激光器除了具有固态光源的优点外，还具有近红外波长调谐范围宽，而近红外比可见光穿透更深，对生物样品的损伤更小。下图是Thorlabs的双光子和三光子显微镜配置，钛宝石飞秒可调谐激光器位于平台左侧。从双光子到三光子科学家们正在从双光子显微镜转向三光子显微镜。1996年，ChrisXu在康奈尔大学(Denk的导师实验室)读博时发明了三光子显微镜。如果双光子吸收是可行的，那么三光子似乎是自然的发展方向。三光子成像使用更长的波长，大约1.3和1.7微米，成像深度比双光子更深。目前录音大约2.2毫米，人的大脑皮层厚度大约4毫米。与双光子显微镜相比，三光子需要使用更强、更短、重复率更低的激光脉冲，这是传统的钛宝石激光器很难满足的，但对于掺镱光纤飞秒光参量放大器，比如我们的Y-Fi光参量放大器(OPA)就非常容易。双光子显微镜知多少。
微型化双光子荧光显微成像改变了在自由活动动物中观察细胞和亚细胞结构的方式，可用于在动物觅食、哺乳、跳台、打斗、嬉戏、睡眠等自然行为条件下，长时程观察神经突触、神经元、神经网络、远程连接的脑区等多尺度、多层次动态变化。该成果在2016年底美国神经科学年会、2017年5月冷泉港亚洲脑科学专题会议上报告后，得到包括多位诺贝尔奖获得者在内的国内外神经科学家的高度赞誉。冷泉港亚洲脑科学专题会议、美国明显神经科学家加州大学洛杉矶分校的AlcinoJSilva教授在评述中写道，“从任何一个标准来看，这款显微镜都了一项重大技术发明，必将改变我们在自由活动动物中观察细胞和亚细胞结构的方式。它所开启的大门，甚至超越了神经元和树突成像。系统神经生物学正在进入一个新的时代，即通过对细胞群体中可辨识的细胞和亚细胞结构的复杂生物学事件进行成像观测。双光子显微镜的探测器,该怎么选用?进口激光双光子显微镜厂家
双光子显微镜使用高能量锁模脉冲器。美国ultima2PPLUS双光子显微镜光子跃迁
由于具有较高输出功率的光源可以提高成像速度，在我们的实验中，时间分辨率主要是受OPO输出可见光激光功率的限制。尽管在单点扫描系统中，v2PE激发会使得空间分辨率提高，但多聚焦v2PE显微镜具有与1PE多聚焦显微镜近乎相同的横向分辨率，这主要是多聚焦成像和单点扫描技术之间的差异造成的。由于v2PE的激发体积小于1PE，引入图像扫描技术可以进一步提高空间分辨率，这种技术需要通过在阵列前引入额外的微透镜阵列来实现。除此之外，由于可见光区域的共振效应，可能会产生光漂白，因而为了延长观察时间，系统还需要对激发强度和曝光时间做进一步优化。美国ultima2PPLUS双光子显微镜光子跃迁
