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  • 江西RNA蛋白相互作用RIP PCR检测,RIP
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RIP基本参数
  • 品牌
  • 广州基云生物
  • 型号
  • GCB2086RIP
RIP企业商机

进行RIP-qPCR实验,应该注意以下几个关键问题,以确保实验的成功和准确性。1. 样本处理:确保样本新鲜且未受污染,避免RNA降解。在处理过程中使用无RNase的试剂和耗材,并在冰上操作以维持低温环境。2. 抗体选择:选择特异性强的抗体进行免疫沉淀,这是实验成功的关键。验证抗体的特异性和效力,以确保准确捕捉目标RNA-蛋白质复合物。3. 引物设计:设计特异性针对目标RNA的引物,避免非特异性扩增。确保引物的质量和纯度,以获得可靠的qPCR结果。4. 实验对照:设置适当的对照实验,如使用非特异性抗体作为阴性对照,以验证实验结果的特异性和准确性。5. 操作规范:严格遵守RNA操作规范,避免RNA酶的污染。确保实验环境的清洁和无菌,以减少误差和干扰。6. 数据分析:使用适当的统计方法和软件分析实验数据,确保结果的准确性和可靠性。注意识别并排除异常值,以获得真实可信的结果。综上所述,进行RIP-qPCR实验时,你应注意样本处理、抗体选择、引物设计、实验对照、操作规范和数据分析等关键问题。通过仔细考虑和遵循这些注意事项,可以提高实验的成功率和准确性。要快速了解RIP实验技术,可以从几个方面入手。江西RNA蛋白相互作用RIP PCR检测

江西RNA蛋白相互作用RIP PCR检测,RIP

RIP实验RNA结合蛋白-RNA复合物的免疫沉淀(RIP)免疫沉淀方法步骤:

制备RIP免疫共沉淀缓冲液。每次免疫沉淀需要900μL的RIP免疫沉淀缓冲液。每个反应在860µL的RIP洗涤缓冲液中加入35μL的0.5MEDTA和5µL的RNase抑制剂。

将第二节第10步中的试管放在磁性分离器上,并丢弃上清液。在每根试管中加入900µL的RIP免疫共沉淀缓冲液。

快速解冻RIP裂解液,在4℃下以14000rpm离心10分钟。取出100µL的上清液,加入RIP免疫沉淀缓冲液中的每个磁珠-抗体复合物。免疫共沉淀反应的ZUI终体积将为1.0mL。 江西RNA蛋白相互作用RIP PCR检测做好RIP实验,应注意哪些常见问题。

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RIP-Seq检测和RIP-qPCR验证要点:

实验设计:尽量进行实验组别设计和生物学重复检测,提高后续验证的阳性率。常规过表达单组(AbIPvsIgGIP);动态互作组学(实验组vs对照组vsIgG组)。根据目的设计适当的生物学重复。如果后续以RIP-Seq数据进行互作组标准分析,则需要3-4组生物学重复;如果后续以寻找关键互作RNA,进行深入的机制研究,则建议1-2次生物学重复。经验显示单次重复假阳性率达90%。RIP-Seq强烈建议设置实验组别和生物学重复检测。

蛋白表达和细胞量:细胞用量要不少于5e7(金标准:320g离心细胞量50μl,保障项目用量)。本底低表达蛋白,建议使用过表达组进行检测。蛋白表达可根据WB结果或初步根据数据库判定。

抗体关键质控:抗体特异性与亲和效价要求高,尽量采用标签抗体或经过CoIP效果验证的抗体。抗体质量参差不齐(WB能检测到预期条带不到1/2,能检测到良好结果的不到1/4)和存在非特异性结合(几乎所有的抗体都存在非特异结合,部分非特异结合条带远大于目的条带),RIP-Seq需做WB和IP-WB质控。抗体可参考数据库。

互作蛋白筛选和验证:数据分析以信号强度作为强阳筛选,以文献查阅,功能匹配,批量RIP-qPCR验证,提高验证成功率。

RNA结合蛋白-RNA复合物的免疫沉淀(RIP)免疫沉淀方法:

1.制备RIP免疫共沉淀缓冲液。每次免疫沉淀需要900μL的RIP免疫沉淀缓冲液。每个反应在860µL的RIP洗涤缓冲液中加入35μL的0.5MEDTA和5µL的RNase抑制剂。

2.将第二节第10步中的试管放在磁性分离器上,并丢弃上清液。在每根试管中加入900µL的RIP免疫共沉淀缓冲液。3.快速解冻RIP裂解液,在4℃下以14000rpm离心10分钟。取出100µL的上清液,加入RIP免疫沉淀缓冲液中的每个磁珠-抗体复合物。免疫共沉淀反应的ZUI终体积将为1.0mL。

4.取出10µL的RIP裂解液上清液,并将其放入一个新的试管中,并贴上“input”的标签。将该样本存储在-80°C,直到开始RNA纯化(第四节)。这表示“10%的input”,将用于生成标准曲线或用于RT-PCR方法的比较(实时或终点)。

5.取出10µL的RIP裂解液上清液,通过蛋白印迹法检测目标RNAbinding蛋白的表达。将10µL的2XSDS-PAGEloading缓冲液加入到10µL的RIP裂解液中,然后在95°C下加热。RIP裂解液可直接应用于SDS-PAGE。

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广州基云生物,在IP互作组检测和关键机制分子筛选验证领域,具有丰富的经验,助力您的互作机制研究。 做好RIP-qPCR实验,需要进行哪些准备。

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RIP(RNA结合蛋白免疫沉淀)和ChIP(染色质免疫沉淀)实验在多个方面存在明显的区别:研究对象:RIP实验主要研究细胞内RNA与蛋白质的相互作用,关注RNA结合蛋白与特定RNA分子的结合情况。ChIP实验则主要关注DNA与蛋白质的相互作用,特别是染色质上的蛋白质与DNA序列的结合。实验原理:RIP实验基于RNA分子与RNA结合蛋白在特定条件下(如紫外照射下)可以发生耦联效应。通过利用特异性抗体将RNA-蛋白质复合物沉淀下来,然后回收其中的RNA进行分析。ChIP实验则是利用特异性抗体与染色质上的蛋白质结合,然后通过洗涤和洗脱步骤将结合的DNA纯化出来,进行高通量测序或其他分析。技术应用:RIP实验是研究转录后调控网络动态过程的有力工具,可以帮助发现miRNA的调节靶点。ChIP实验则常用于研究基因表达调控、转录因子结合位点、染色质修饰等。综上所述,RIP和ChIP实验在研究对象、实验原理、实验操作、优化条件和技术应用等方面存在明显差异。RIP-seq主要应用于识别和分析与特定RNA结合蛋白(RBP)结合的RNA分子。海南RIP PCR

RIP是一种用于研究RNA与蛋白质相互作用的实验方法,实验步骤有哪些。江西RNA蛋白相互作用RIP PCR检测

RIP-Seq检测和RIP-qPCR验证优劣势:优势:高通量获得目的蛋白的专属RNA互作库,获得目的蛋白的互作RNA机制分子。劣势:RIP-Seq的RNA库鱼龙混杂,包含目的蛋白的直接/间接的互作RNA,非特异结合,残留RNA。RIP-Seq技术和分析门槛高;RIP-qPCR验证成功率低,导致研发进展反复跌宕、时间和经费成本占用较大,严重影响士气。该项目的成功实施,比较依赖成熟和有分析经验的团队,强烈建议整包交给专业的服务商开展检测。

广州基云专注互作机制研究,致力于让实验更简单高效。 江西RNA蛋白相互作用RIP PCR检测

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