Itrytoexplainwhytwo-photonmicroscopyhasadeeperimagingdepththanone-photonmicroscopy,intheareaofbiomedicalimaging.Manyofthebiomedicalimagingmodalities,nomatterone-photon(confocal)ormulti-photon(two-photon),uselasersaslightsourceandrequirecompatiblefluorescentdyes.Fluorescentdyeshavetheirownexcitationwavelength,andtheycaneitherbeexcitedbyasinglephotonwiththephotonenergyofthatexcitationwavelength(E=hv=h*c/λ);orbytwophotons,arrivingalmostatthesametime,buteachwithapproximatelyhalfoftheenergy,henceofdoublewavelengththanone-photon(0.5E->2λ).Theformeristheprincipleofone-photonmicroscopyandthelatteristheprincipleoftwo-photonmicroscopy.Whenimagingthesamefluorescentdye,sincetwo-photoncoulduseapproximatelydoubledwavelengthcomparedwithsingle-photon,two-photoncanobviouslypenetrateddeeperintothetissueduetolessscattering(longerwavelength,lessscattering).优势来源于其双光子光源的非线性光学效应。国内ultima2PPLUS双光子显微镜分辨率是多少
在深度组织中以较长时间对活细胞成像，双光子显微镜是当前之选。双光子和共聚焦显微镜都是通过激光激发样品中的荧光标记，使用探测器测量被激发的荧光。但是，共聚焦一般使用单模光纤耦合激光器，通过单光子激发荧光，而双光子使用飞秒激光器，通过几乎同时吸收两个长波光子激发荧光。下面是两种技术的对比图。双光子激发荧光的主要优势：双光子比共聚焦使用的更长的波长，所以对组织的损伤更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般为100微米，双光子则能达到250到500微米，甚至超过1毫米。另外，同时吸收两个光子意味只有较强度聚焦点处能被激发，所以不会损伤焦平面之外的组织，并且生成更清晰的图像。荧光激光双光子显微镜分辨率是多少双光子显微镜使用的是高能量锁模脉冲器。
后续实验使用碘化丙啶(PI)来指示细胞在7、8、9和10分钟的延时观察后的损伤情况，来验证该光学系统对活细胞长期观察的适用性。在观察期间，88个焦点以100毫秒的曝光时间，曝光间隔1s照射样品，激发强度为3.21×104W/cm2，激发波长为525nm，使用前文提到的60×物镜及1.0AU孔径，图5(a)-(d)为引入PI的成像图，(e)-(h)为相应的相应衬度图。改变激发条件为每照射500ms间隔5s，得到相应的(i)-(p)。由图像可知，延时观察小于8分钟的情况下不造成可见细胞损伤，对于实际3D延时成像，由于焦平面是移动的，所以预期细胞存活时间会更长，可见这是一种在3D在体延时成像中具有很大优势的成像方案。
共聚焦显微可以呈现这么漂亮的图像，是不是什么样品都可以用共聚焦显微镜拍拍拍.....得到各种各样清晰漂亮的图像呢？答案是否定的，任何事物都有优缺点，何况一台仪器呢，共聚焦显微镜也是有自己的局限,共聚焦有哪些局限呢：1.共聚焦显微镜只能拍摄约200um以内的的样品，对于厚的或者样品不能进拍摄；2.共聚焦显微镜由于是逐点进行扫描，对样品的光毒性还是比较大的，特别是拍摄活细胞样品时就更容易对样品进行淬灭；3.由于光照射的区域几乎能通过这个Z轴的层面，所以对于空间定点光刺激的实验定点位置就不是特别精确；并且激光共聚焦显微镜没有纯紫外进行激发，对于一些特殊激发波长的实验，效率非常低。双光子显微镜的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有100飞秒，而其周期可以达到80至100兆赫兹。双光子显微镜是结合了双光子技术和扫描共聚显微镜的一种新型荧光显微镜。
通过并行化不同激光波长的激光扫描，研究人员增加了在相同时间内可以成像的体积，同时保持了高的时间和空间分辨率。研究人员通过引入两种不同波长的钙信号荧光探针，将神经元群体的活动标记为两种不同的颜色，同时激发两种不同波长的探针，从而实现了两种颜色的并行数据记录。为了实现三维空间成像，研究人员还在两个激光束上配置了快速变焦系统，即一个电透镜和一个空间光调制器。因此，可以以10Hz的速度同时记录10个500微米和500微米的平面，覆盖600微米的深度，覆盖大脑皮层第二层到第五层的结构，体积内可以记录2000多个神经元。双光子显微镜的应用中，该如何选择以及更好的使用PMT。国外双光子显微镜光毒性
于双光子激发需要两个光子同时到达，因此只有在焦点附近的样品区域才会激发，从而实现三维成像和高分辨率。国内ultima2PPLUS双光子显微镜分辨率是多少
双光子显微镜的优势：在深度组织中以较长时间对活细胞成像，双光子显微镜是当前之选。双光子和共聚焦显微镜都是通过激光激发样品中的荧光标记，使用探测器测量被激发的荧光。但是，共聚焦一般使用单模光纤耦合激光器，通过单光子激发荧光，而双光子使用飞秒激光器，通过几乎同时吸收两个长波光子激发荧光。下面是两种技术的对比图。双光子激发荧光的主要优势：双光子比共聚焦使用的更长的波长，所以对组织的损伤更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般为100微米，双光子则能达到250到500微米，甚至超过1毫米。另外，同时吸收两个光子意味只有度聚焦点处能被激发，所以不会损伤焦平面之外的组织，并且生成更清晰的图像。国内ultima2PPLUS双光子显微镜分辨率是多少
