双光子的来源:飞秒激光的双光子吸收理论早在1931年就由诺贝尔奖获得者MariaGoeppertMayer提出，并在30年后因为激光而得到实验验证，但WinfriedDenk用了近30年才发明了双光子显微镜。要理解双光子的技术挑战和飞秒激光发挥的重要作用，首先要理解非线性过程。双光子吸收相当于和频产生的非线性过程，需要极高的电场强度，电场取决于聚焦光斑的大小和激光脉冲宽度。聚焦光斑越小，脉冲宽度越窄，双光子吸收效率越高。对于衍射极限显微镜，聚焦在样品上的光斑大小只与物镜NA和激光波长有关，所以关键变量只有激光脉冲宽度。基于以上分析，能够输出高重复率(100MHz)的超短脉冲(100fs量级)的飞秒激光已经成为双光子显微镜的标准激发光源。这再次显示了双光子显微镜的优势:双光子吸收只能在焦平面形成，而在焦平面之外，由于光强较低，无法激发，所以双光子成像更清晰。双光子显微镜结合了双光子激发技术和激光扫描共聚显微镜。国内2PPLUS双光子显微镜代理商
双光子之源：飞秒激光双光子吸收理论早在1931年就由诺奖得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因为有了激光才得到实验验证，但是到WinfriedDenk发明双光子显微镜又用了将近30年。要理解双光子的技术挑战和飞秒激光发挥的重要作用，首先要了解其中的非线性过程。双光子吸收相当于和频产生非线性过程，这要求极高的电场强度，而电场取决于聚焦光斑大小和激光脉宽。聚焦光斑越小，脉宽越窄，双光子吸收效率越高。对于衍射极限显微镜，聚焦在样品上的光斑大小只和物镜NA和激光波长有关，所以关键变量只剩下激光脉宽。基于以上分析，能够以高重频(100MHz)输出超短脉冲(100fs量级)的飞秒激光器成了双光子显微镜的标准激发光源。这也再次说明双光子显微镜的优势：只有焦平面处才能形成双光子吸收，而焦平面之外由于光强低无法被激发，所以双光子成像更清晰。布鲁克双光子显微镜成像原理是什么双光子显微镜还可以对一些具有特性的染料细胞进行实验，还有一些短波长可以利用双光子特性进行特定实验。
第二代微型化双光子荧光显微镜FHIRM-TPM2.0，其成像视野是该团队于2017年发布的代微型化显微镜的7.8倍，同时具备三维成像能力，获取了小鼠在自由运动行为中大脑三维区域内上千个神经元清晰稳定的动态功能图像，并且实现了针对同一批神经元长达一个月的追踪记录。在一批“早鸟项目”中，该系统已被多个研究组应用于不同的模式动物和行为范式，如小鼠的社交新颖性识别、斑胸草雀受调控后大脑特定神经元变化、新型神经递质乙酰胆碱探针的传导适应性分析以及猕猴三脑区成像等多项研究。
随着技术的发展，双光子显微镜的性能不断优化。结合其特点，大致可以分为两个方面:深入和主动改进。为了使激发激光进入更深的层次，可以从器件优化和标本改造两个方面入手。关于器件的优化，我们可以把激光束做得更细，集中能量，让激光穿透得更深。对于样品，物质的吸收和散射是影响光传播的主要因素。为了解决这个问题，我们需要将样本透明化。一种方法是用某种物质浸泡标本，使其中的物质(主要是脂质)被破坏或溶解。另一种方法是通过电泳电解脂类，从而提高标本的“透明度”。双光子显微镜在各领域研究中已有许多成功实例。
从双光子的原理和特点我们就可以明显的得出双光子的优点：☆穿透能力强：相对于紫外光，可见光和近红外光都具有更强的穿透能力，因而受生物组织散射的影响更小，解决对生物组织中深层物质的层析成像研究问题；☆高分辨率：由于双光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的区域内可以激发出荧光，双光子吸收局限于焦点处的体积约为波长3次方的范围内；☆漂白区域小：由于激发只存在于交点处，所以焦点以外的区域都不会发生光漂白现象；☆荧光收集率高：与共聚焦成像相比，双光子成像不需要光学滤波器（共焦），这样就提高了对荧光的收集率，而收集率的提高直接导致图像对比度的提高。上海双光子显微镜就找因斯蔻浦。国内bruker双光子显微镜荧光寿命计数
双光子显微镜中，同样每个时刻只有焦平面上一个点的信号被探测，并且连焦平面外的荧光信号也不会有。国内2PPLUS双光子显微镜代理商
王爱民副教授结合工作实例，展示了双光子显微镜的研发与应用。历经3年多的协同奋战，成功研制新一代高速分辨微型化双光子荧光显微镜，重量只为2.2克，这一微型显微镜获取了小鼠在自由行为过程中大脑神经元和神经突触活动清晰、稳定的图像，该显微镜适于佩戴在小动物头部，可实时记录数十个神经元、上千个神经突触的动态信号，在大型动物上，还可望实现多探头佩戴、多颅窗不同脑区的长时程观测。双光子显微成像的在生物医学研究和医疗领域应用有较大的应用前景，首先双光子显微镜能够进行细胞和组织结构成像，在亚微米级成像，此功能与目前市场上的共聚焦类显微镜性能类似；双光子显微成像能够实时、在体、原位、无创地，根据不同物质组份的光谱特性，区分成像；双光子显微镜能够进行生化指标成像，在无造影剂的前提下，利用自发荧光、二次谐波、荧光获得活细胞生化信息。国内2PPLUS双光子显微镜代理商
