免疫沉淀Co-IP实验中磁珠还是琼脂糖珠的选择取决于客户实验情况。
琼脂糖珠海绵状的结构 (直径 50-150 μm) 可以结合抗体 (继而结合靶蛋白) ,它能够直接高效、快速结合抗体,而不需借助特殊的专业设备。琼脂糖珠呈多孔结构,这使得它们拥有更大的表面积可与蛋白质相互接触,具有更高的结合载量。
与琼脂糖珠不同,磁珠是固体,抗体的结合限于磁珠的表面。磁珠 (直径 1-4 μm) 明显小于琼脂糖珠 ,尽管磁珠没有多孔中心增加结合能力,但每体积的磁珠数量比琼脂糖珠多,使磁珠拥有足够的抗体结合表面积满足高容量的抗体结合。
简而言之,琼脂糖珠的结合能力较强,而磁珠在得率,可重复性以及自动化方面有明显的优势。
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免疫共沉淀分析(Co-IP)实验原理与IP十分类似,基本的技术都是采用目标抗原特异性的固相化抗体;但IP的目标是纯化单一抗原,而Co-IP旨在分离抗原及与抗原结合的蛋白质或配体。
在Co-IP实验中,已知抗原称为诱饵蛋白,与之结合的蛋白则称为靶蛋白。靶蛋白可能是一些复杂的伴侣蛋白、信号分子、结构蛋白、辅助因子等,蛋白间相互作用强度范围可能介于高度瞬时和十分稳定之间。基本的Co-IP实验方案与IP相同,实际上任何IP系统均可用于Co-IP。但是,还有许多其他因素需要考虑,例如,结合和洗涤条件的优化,优化时,需要考虑到诱饵蛋白-靶蛋白的相互作用强度以及抗体-诱饵蛋白的亲和力。
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免疫沉淀技术(Immunoprecipitation, IP)是一种用于研究蛋白质相互作用、蛋白质复合物组成以及特定蛋白质的表达和纯化的实验技术。
基本原理
免疫沉淀技术基于抗体与特定蛋白质(抗原)之间的特异性相互作用。通过使用针对目标蛋白质的特异性抗体,可以从含有多种蛋白质的复杂样本中捕获并富集目标蛋白质。
免疫沉淀技术有多种类型,包括:
1. 个别免疫沉淀法(Individual IP)
2. 免疫共沉淀法(Co-IP)
3. 染色质免疫沉淀法(ChIP)
4. RNA免疫沉淀法(RIP)
近年来,免疫沉淀技术在固相支持物的选择上有了很大进步。磁性微珠因其操作简便、快速和自动化程度高而逐渐取代了传统的琼脂糖树脂。
免疫沉淀(Co-IP)实验中抗体的选择非常关键,因为抗体的特异性和亲和力直接影响到实验的成功与否。
1. 特异性:抗体应当对目标蛋白具有高度的特异性,以避免与其他蛋白发生非特异性结合,导致假阳性结果。
2. 亲和力:抗体对目标蛋白的亲和力要足够高,以确保在免疫沉淀过程中能够有效地捕获目标蛋白。
3. 抗体类型:单克隆抗体和多克隆抗体都可以用于IP实验。单克隆抗体提供更高的特异性和批间一致性,而多克隆抗体可能提供更强的结合能力和更广的表位覆盖。
4. 应用验证:选择已经过免疫沉淀(Co-IP)或相关应用(如Western blot, IHC)验证的抗体,这增加了实验成功的可能性。
5. 供应商信息:选择信誉良好的抗体供应商,并查看供应商提供的技术数据和客户评价,以帮助做出决策。
免疫沉淀技术ChIP的原理是什么?
免疫沉淀实验步骤:
1. 样品制备
a. 悬浮细胞样品处理:离心收集细胞(4℃, 1000g, 5 min),用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制剂的裂解液(裂解液应在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂Cocktail,使蛋白酶抑制剂Cocktail的终浓度为1×)。混匀后置于冰上处理10 min;离心收集上清液(4℃, 14000g, 10 min),置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)。
b. 贴壁细胞样品处理:移去培养基,用PBS清洗细胞两遍;用细胞刮棒刮脱细胞,收集至1.5mL EP管内,按照6孔板每孔加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制剂的裂解液(裂解液应在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂Cocktail,使蛋白酶抑制剂Cocktail的终浓度为1×)。吹打数下,使裂解液和细胞充分接触。混匀后置于冰上处理10 min;离心收集上清液(4℃, 14000g, 10 min),置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)。
4. 后续:磁珠预处理——抗体吸附——抗原结合反应——抗体洗脱
免疫沉淀技术IP的实验设计。
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免疫沉淀技术(Immunoprecipitation, IP)在生物医学研究中有着广泛的应用,以下是一些主要的应用领域:
1. 蛋白质相互作用研究:IP技术可以用来研究蛋白质之间的相互作用,揭示蛋白质复合物的组成和蛋白质之间的相互作用网络。
2. 信号转导研究:通过IP技术,可以富集信号转导通路中的关键蛋白质,研究信号转导的机制和调控[。
3. 蛋白质修饰研究:IP技术可以用于富集经过特定修饰的蛋白质,例如磷酸化、乙酰化等,进而研究蛋白质修饰的功能和调控。
4. 药物靶点筛选:IP技术可以用于富集药物靶点蛋白质,帮助筛选潜在的药物靶点。
5. 疾病机制研究:通过分析疾病相关蛋白质的相互作用,IP技术有助于揭示疾病的分子机制,为理解疾病的发展过程和寻找靶点提供重要信息。
6. 药物相互作用分析:IP技术可以用于分析药物与蛋白质的相互作用,为药物作用机制研究提供重要信息。
7. 生物标志物发现:IP技术可以用于鉴定与疾病状态相关的蛋白质相互作用,筛选出潜在的生物标志物,用于疾病的诊断和预后评估。
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