双光子之源：飞秒激光：双光子吸收理论早在1931年就由诺奖得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因为有了激光才得到实验验证，但是到WinfriedDenk发明双光子显微镜又用了将近30年。要理解双光子的技术挑战和飞秒激光发挥的重要作用，首先要了解其中的非线性过程。双光子吸收相当于和频产生非线性过程，这要求极高的电场强度，而电场取决于聚焦光斑大小和激光脉宽。聚焦光斑越小，脉宽越窄，双光子吸收效率越高。对于衍射极限显微镜，聚焦在样品上的光斑大小只和物镜NA和激光波长有关，所以关键变量只剩下激光脉宽。基于以上分析，能够以高重频(100MHz)输出超短脉冲(100fs量级)的飞秒激光器成了双光子显微镜的标准激发光源。这也再次说明双光子显微镜的优势：只有焦平面处才能形成双光子吸收，而焦平面之外由于光强低无法被激发，所以双光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飞秒激光器(100fs脉宽、630nm可见光波长)。虽然染料激光器对于实验室演示尚可，但是使用很不方便所以远未实现商用。很快双光子显微镜的标配光源就变成了飞秒钛宝石激光器。除了固态光源优势，钛宝石激光器还具有较宽的近红外波长调谐范围，而近红外相比可见光穿透更深，对生物样品损伤更小。由于其非侵入性和高分辨率的特点，双光子显微镜成为了研究神经科学、ai症研究、免疫学等领域的重要工具。国外荧光双光子显微镜授权供应商
从双光子的原理和特点，我们可以清楚地得出双光子的优点:☆光损伤小:由于双光子显微镜采用可见光或近红外光作为激发光源，因此该波段的光对细胞和组织的光损伤很小，适合长期研究；☆穿透能力强:与紫外光相比，可见光和近红外光的穿透能力更强，因此受生物组织散射的影响更小，解决了生物组织深层物质的层析成像问题；☆高分辨率:由于双光子吸收的截面很小，只能在焦平面很小的区域激发荧光，双光子吸收被限制在焦点处体积约为波长三次方的范围内；☆漂白区域小:由于激发只存在于交点处，焦点外的区域不会发生光漂白；☆荧光收集率高:与共焦成像相比，双光子成像不需要滤光片(共焦)，提高了荧光收集率，直接导致图像对比度的提高；☆图像对比度高:由于荧光波长小于入射波长，瑞利散射产生的背景噪声*为单光子激发产生的1/16，减少了散射的干扰；光子跃迁具有很强的选择性激发，因此可以用来对生物组织中的一些特殊物质进行成像；2PPLUS双光子显微镜成像原理是什么双光子显微镜在组织透明化成像中应用；
其实电子显微镜相比光学显微镜的重要优势或意义不在于放大倍数，而在于超高的分辨率。这两者是不同的。一般来说，观察时，除了放大物体外，还需要将其与其他相邻物体区分开来。如果两个相邻粒子的图像在光学显微镜下，即使放大很大程度，也可能看到两个相交的亮点(艾里斑)，没有明显的边界(更不用说细节了)，说明分辨率不够。没有分辨率谈放大是没有意义的。光学显微镜的分辨率极限是阿贝极限，大约是光波波长的一半。通常称之为光学显微镜的放大极限，但准确的说应该叫分辨率极限。原因是光的衍射，根本原因是光的波粒二象性。电子衍射实验证明了电子的波动性，所以在电子显微镜中用电子代替光是可能的。电子显微镜也有很多种，被摄体像REM。也有根据衍射规律观察的电子显微镜，如低能电子衍射(LEED)和透射电子显微镜(TEM)。两者主要用于观察晶体，根据晶体的周期特性在倒易空间产生衍射像，借助埃尔沃德球或傅里叶变换将其变换到实空间，即可得到真实的晶体表面像。
在深度组织中以较长时间对活细胞成像，双光子显微镜是当前之选。双光子和共聚焦显微镜都是通过激光激发样品中的荧光标记，使用探测器测量被激发的荧光。但是，共聚焦一般使用单模光纤耦合激光器，通过单光子激发荧光，而双光子使用飞秒激光器，通过几乎同时吸收两个长波光子激发荧光。双光子激发荧光的主要优势：双光子比共聚焦使用的更长的波长，所以对组织的损伤更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般为100微米，双光子则能达到250到500微米，甚至超过1毫米。另外，同时吸收两个光子意味只有度聚焦点处能被激发，所以不会损伤焦平面之外的组织，并且生成更清晰的图像。双光子显微镜结合了双光子激发技术和激光扫描共聚显微镜。
双光子显微镜为什么穿透能力强？生物组织在近红外波段存在两个窗口,第1个近红外窗口对应波长在700nm-900nm,第2个近红外窗口对应波长在1000nm-1400nm之间。举例说明就是单晶硅对于可见光几乎是不透明的，但是对于红外波段就像是“水晶”一样通透性很好了。原因有两点：1.生物组织对红外光的吸收弱，对可见光吸收强。类似的，平时用手电筒照射手指，会看到手通透红亮，也是由于生物组织对长波长的红光吸收少。2.生物组织对红外光的散射弱。因为瑞利散射的强度反比于波长λ的四次方。类似的，早晨的太阳非常红，也就是因为长波长的红光穿透力更强。这两点共同导致长波长的红外光比可见光对生物组织的穿透能力强。双光子显微镜有哪些分类呢？国外布鲁克双光子显微镜代理商
双光子显微镜是新型的荧光显微镜，其原理大致是这样的；国外荧光双光子显微镜授权供应商
双光子显微成像的在生物医学研究和医疗领域应用有较大的应用前景，首先双光子显微镜能够进行细胞和组织结构成像，在亚微米级成像，此功能与目前市场上的共聚焦类显微镜性能类似；双光子显微成像能够实时、在体、原位、无创地，根据不同物质组份的光谱特性，区分成像；双光子显微镜能够进行生化指标成像，在无造影剂的前提下，利用自发荧光、二次谐波、荧光获得活细胞生化信息。双光子显微镜技术在医疗诊断应用中具有巨大的潜力，该领域还未形成标准和体系，需要系统的医学研究与庞大的医疗数据加以支撑，通过研究人体基于多光子成像技术，进行细胞结构、生化成分、微环境、组织形态、代谢功能的影响信息，找到与疾病的细胞学、分子生物学、组织病理学、诊断和***特征的关联关系，共同探究生理病理基础和分子细胞生物学机制，筛选鉴定**、皮肤病、自身免疫病及其他疑难疾病的诊断及鉴别诊断依据，建立全新的多光子细胞诊断的完整数据库，定义出针对不同疾病的多光子临床检测设备的产品标准。国外荧光双光子显微镜授权供应商
