指示剂是如何负载细胞，目前有三种在神经元上填充钙离子指示剂的方法，且都可以用于体内和体外研究。第一种方法是利用玻璃吸管将膜渗透性盐或葡聚糖形式的指示剂注入单个神经元中。此方法方便实验者控制单个神经元内的钙离子指示剂浓度且信噪比较高。第二种是利用“批量加载”的方法将钙离子指示剂染料负载神经元，观察对象为一群神经元。尽管此方法可能导致一些胶质细胞也被指示剂所标记，但明显提高了整体神经元的标记百分比，使研究者得以观察到一群神经元内动作电位相关性的活动。第三种也较为常用，通过病毒转染的方式使其基因编码钙离子指示剂。（A）单细胞注射法；（B）networkloading法；（C）通过病毒转染使其基因编码钙离子指示剂（expressionofgeneticallyencodedcalciumindicators,GECI）双光子显微镜可以在小鼠的的任何部位进行有生命体成像。进口激光荧光双光子显微镜商家电话
第二代微型化双光子荧光显微镜FHIRM-TPM2.0，其成像视野是该团队于2017年发布的代微型化显微镜的7.8倍，同时具备三维成像能力，获取了小鼠在自由运动行为中大脑三维区域内上千个神经元清晰稳定的动态功能图像，并且实现了针对同一批神经元长达一个月的追踪记录。在一批“早鸟项目”中，该系统已被多个研究组应用于不同的模式动物和行为范式，如小鼠的社交新颖性识别、斑胸草雀受调控后大脑特定神经元变化、新型神经递质乙酰胆碱探针的传导适应性分析以及猕猴三脑区成像等多项研究。进口ultima2PPLUS双光子显微镜授权商双光子显微镜使用长波长脉冲光，是通过物镜汇聚的。
2020年，临研所、病理科和科研处邀请北京大学王爱民副教授做了题目为“新一代微型双光子显微成像系统介绍及其在临床医疗诊断”的学术报告。学术报告由临研所医学实验研究平台潘琳老师主持。王爱民，北京大学信息科学技术学院副教授，毕业于北京大学物理系，获学士、硕士学位，后于英国巴斯大学物理系获博士学位。该研究组研发的微型双光子显微镜，第1次在国际上获得了小鼠大脑神经元和神经突触清晰稳定的动态信号，该成果获得了2017年度“中国光学进展”和“中国科学进展”，并被NatureMethods评为2018年度“年度方法--无限制行为动物成像”。目前，该研究组正在研究新一代双光子显微成像技术在临床诊断中的应用，为未来即时病理、离体组织检测、术中诊断等提供新的影像手段和分析方法。
双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双（多）光子成像优势在于，具有更深的组织穿透深度，利用红外光，能够在层面检测极限达1mm的组织区域；因信号背景比高，而具有更高的对比度；因激发体积小，具有定点激发的特性，具有更少的光毒性；激发波长由紫外、可见光调整为红外激发，使其能够更加安全。双光子显微镜只有焦平面处才能形成双光子吸收，而焦平面之外由于光强低无法被发动，所以双光子成像更清晰。
双光子吸收理论早在1931年就由诺奖得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因为有了激光才得到实验验证，但是到WinfriedDenk发明双光子显微镜又用了将近30年。要理解双光子的技术挑战和飞秒激光发挥的重要作用，首先要了解其中的非线性过程。双光子吸收相当于和频产生非线性过程，这要求极高的电场强度，而电场取决于聚焦光斑大小和激光脉宽。聚焦光斑越小，脉宽越窄，双光子吸收效率越高。对于衍射极限显微镜，聚焦在样品上的光斑大小只和物镜NA和激光波长有关，所以关键变量只剩下激光脉宽。基于以上分析，能够以高重频(100MHz)输出超短脉冲(100fs量级)的飞秒激光器成了双光子显微镜的标准激发光源。这也再次说明双光子显微镜的优势：只有焦平面处才能形成双光子吸收，而焦平面之外由于光强低无法被激发，所以双光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飞秒激光器(100fs脉宽、630nm可见光波长)。虽然染料激光器对于实验室演示尚可，但是使用很不方便所以远未实现商用。很快双光子显微镜的标配光源就变成了飞秒钛宝石激光器。除了固态光源优势，钛宝石激光器还具有较宽的近红外波长调谐范围，而近红外相比可见光穿透更深，对生物样品损伤更小。双光子显微镜将得到更大的发展与更广的应用。国外荧光双光子显微镜最大分辨率
双光子显微镜可以进行厚的组织样品拍摄。进口激光荧光双光子显微镜商家电话
双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。双光子激发的基本原理是:在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子，在经过一个很短激发态后，发射出一个波长较短的光子;其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。因其光损伤小、使得观察荧光细胞成为可能。中国医学科学院医学实验动物研究所-双光子显微镜成像平台借助于双光子显微镜成像技术及不同转基因小鼠开展对多种脏器的成像研究。以小鼠颅内成像为优势，可观察小鼠颅内神经细胞、小胶质细胞/巨噬细胞、周细胞、血管、转移瘤细胞、胶质瘤细胞等的变化情况，在**学、神经生物学、发育生物学、神经退行性疾病等领域具有广泛应用。小鼠其它组织脏器，如脾、颅骨、股骨、胸骨等也可借助本平台进行成像研究。进口激光荧光双光子显微镜商家电话
