三、细胞实验D-荧光素钾盐体外生物发光试验：D-荧光素钾盐，无菌纯水，完全培养基（自行配制）1、贴壁细胞：将细胞接种于培养板中孵育数小时或过夜，使细胞贴壁。悬浮细胞：可以将细胞接种于培养板后直接进行后续操作，无需孵育。如果倍增时间相对较短，则应考虑倍增时间进行细胞计数。2、将15mg荧光素钾盐溶解于1ml无菌水中，制备成100X荧光素储备液（15mg/ml），轻轻颠倒摇动至荧光素钾盐完全溶解。混匀后立即使用或分装后-20℃冻存。3、用预热好的细胞培养基1∶100稀释100X荧光素储备液（15mg/ml），配制成荧光素工作液（终浓度150μg/ml），即配即用。4、去除培养板中的培养基。5、在成像前，将适量荧光素工作液加入细胞中，然后进行图像分析。注意：成像前在37℃下对细胞进行短时间孵育可增强信号。孵育时间取决于特定的细胞类型。一般来说孵育10分钟就足够了，根据需要进行测试和调整。6、每隔10分钟，**多40分钟，使用VILBERFUSIONFX成像系统检查体外生物发光，确定动力学曲线并找出细胞的峰值成像时间点非磺化花青类染料- 该组中的一些染料包括 cy3、cy3.3、cy5、cy5.5、cy7 和 cy7.5。海南脂质荧光染料
管可用于实验室的荧光团数量众多，但这些染料通常属于以下三组之一：荧光染料:这些是用于在体外标记生物相关分子的小型有机天然或合成荧光分子。该组中的一些荧光染料包括荧光素、溴化乙锭和花青。荧光蛋白:这些是较大的、生物制造的蛋白质，由于它们的大分子结构而发出荧光。GFP、RFP和YFP是属于该组的一些染料。量子点:这些高荧光合成纳米晶体由半导体材料制成。随着荧光基本特性的广泛应用和该领域的显着进步，已经针对特定应用和仪器开发和优化了数百种活性荧光染料。同样，多年来，大量复杂的荧光技术（例如，FRET、TRF、FP、FRAP、FACS、FCS）也在不断发展。浙江荧光染料Alexa fluorCy7 DiC18（DiR）是一个亲脂性、近红外荧光花青染料，这个染料常用于标记细胞质膜。
Cy5:激发波长633/635nm，比较大发射波长670nm。1)其标记的抗体适用于所有配备633nm氟离子激光器的流式细胞仪;2)在流式细胞仪的FL4通道检测;3)适用于荧光显微镜技术;4)同样为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于APC。5)与单核和粒细胞非特异性结合多，易出现假阳性结果。
5、PE:激发波长488nm，比较大发射波长575nm。1)其标记的抗体适用于所有配备488nm氯离子激光器的流式细胞仪:2)在流式细胞仪的FL2通道检测;3)其荧光泯灭性强，不适用于传统的荧光显微镜技术，但适用于激光共聚焦显微镜技术。
6、PE-TR:激发波长488nm，比较大发射波长615nm。1)在BeckmanCoulter流式细胞仪的FL3通道检测;2)可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。
7、PE-AlexaFluor610:激发波长488nm，比较大发射波长628nm。1)在BeckmanCoulter流式细胞仪的FL3通道检测;2)荧光强度高;3)可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。
D-荧光素是荧光素酶 (Luc) 的天然底物，可催化萤火虫产生典型的黄绿色光。该反应的 560 nm 化学发光在几秒钟内达到峰值，当底物荧光素过量时，光输出与荧光素酶浓度成正比。荧光素酶 (luc) 基因是用于研究和药物筛选的流行报告基因。化学发光技术几乎没有背景，使得 luc 报告基因成为检测低水平基因表达的理想选择。标准闪烁计数器可以可靠地测量低至 0.02 pg 的荧光素酶。除了作为基因表达报告者的作用外，荧光素酶还常用于极其灵敏的 ATP 检测中[1]。我们提供萤火虫荧光素酶 (HY-P1004)、荧光素游离酸 (HY-12591A) 及其水溶性钠盐 (HY-12591) 和钾盐 (HY-12591B)。吲哚菁绿在生物识别和药物输送方面也有广泛的应用。
如何选择的染料？
考虑到荧光染料种类繁多，您如何为您的特定应用选择使用哪种染料？以下是您需要考虑的一些因素。※与实验设计的兼容性：虽然它们可能与其他荧光团共享一些光谱相似性，但每种染料都是***的，并且具有不同的功能、激发和发射波长、波段形状和宽度以及光稳定性。为确保成功，请选择与您的实验设计相辅相成的一种。与设备的兼容性：选择与您正在使用的照明源相匹配的染料。在选择合适的荧光仪器时，请考虑仪器的灵敏度、动态范围、稳定性和通量、信噪比和信空白比。为了获得更好的结果，请确保染料的发射曲线与可用的检测方法相匹配。与样品中其他荧光材料的相容性：在双重或三重标记实验中，您选择的染料的发射和激发曲线不应与其他荧光团重叠。由于许多天然存在的细胞成分会以与您选择的染料或探针相同的波长发出荧光，因此您还需要确保可以从背景自发荧光中清楚地识别所选染料产生的信号。 南京星叶生物科技有限公司Super Fluor系列（效果同Alexa Fluor 系列）。荧光素钾盐荧光染料Alexa fluor
D-荧光素是荧光素酶 (Luc) 的天然底物，可催化萤火虫产生典型的黄绿色光。海南脂质荧光染料
Hoechst33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。用于细胞核染色时，推荐的Hoechst33258工作浓度为0.5-10μg/ml。储存条件：-20℃干燥避光保存，有效期一年。注意事项：Hoechst33258对人体有害，请注意适当防护。荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽量当天完成检测。为减缓荧光淬灭可以使用抗荧光淬灭封片液。抗荧光淬灭封片液(P0126)可以向碧云天订购。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作注意事项：Hoechst33342对人体有一定刺激性，请注意适当防护。荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽量当天完成检测。为减缓荧光淬灭可以使用抗荧光淬灭封片液。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。海南脂质荧光染料
