经典的慢病毒载体(LV)的生产工艺如下,——三质粒系统瞬时转染HEK293细胞系,转染24小时后LV由转染阳性细胞生产并排出到培养上清液中;收获上清培养液后,加入核酸酶去除HCD污染,通过澄清步骤去除大的细胞碎片等杂质;下游纯化步骤分离LV载体,纯化方法包括切向流过滤TFF、色谱纯化及超速离心;纯化后的LV病毒颗粒经过无菌过滤,更换到优化后的配方中,灌装并冷冻保存。每批Car-T生产时取对应量的LV病毒,切忌反复冻融,否则LV病毒会失活。相比全能核酸酶,M-SAN HQ中盐核酸酶能将HCD酶切成更小片段,破坏核小体结构。浙江ArcticZymes中盐核酸酶
ArcticZymes Technologies于2019年推出了M-SAN HQ中盐核酸酶,2021年推出对应的M-SAN HQ ELISA kit。该试剂盒原理是采用双抗夹心法定量检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中M-SAN HQ中盐核酸酶的残留含量,特异性的anti-M-SAN作为捕获抗体偶联在孔板上,辣根过氧化酶HRP标记anti-M-SAN作为检测抗体,TMB是检测反应底物。该试剂盒特异识别M-SAN HQ中盐核酸酶,对其它核酸酶没有特异性结合。它的定量范围是0.12-7.5ng/ml;12*8strips的设计规格,使用灵活,更能降低使用成本。浙江ArcticZymes中盐核酸酶ArcticZymes Technologies的研发基于北极海洋区的自然资源;
此外,文章作者对每个步骤的样品进行纳米颗粒分析(NTA),结果发现:澄清环节后,M-SAN HQ中盐核酸酶和Benzonase处理组才出现比较明确的LV病毒颗粒峰;TFF处理后,回流液样品的LV病毒颗粒峰更加尖锐,表明病毒颗粒分散度更好、稳定性更高。回流液的NTA结果进一步表明,M-SAN HQ中盐核酸酶处理组只有一个病毒颗粒峰,而Benzonase处理组的回流液中有三个峰。作者推测Benzonase处理组的病毒颗粒还有严重的病毒团聚现象,而呈现多峰现象。
上海倍笃生物科技有限公司(简称“倍笃生物”),由中国科学院及生物医药产业界人士,于2018年1月共同创立。公司代理多个品牌的仪器、试剂及耗材,遵守相关法规要求,如cGMP规范、ISO13485质量管理体系认证等,致力于为诊断领域如分子诊断及病原微生物检测研发等,药物研发领域如细胞基因药物、核酸药物、抗体药物、干细胞及外泌体研究等客户提供合规、高质量物料及专业服务,以期与客户共同协作,加快研发及生产进度,为客户提供更多价值。在已有工艺中,不需做任何调整,用中盐核酸酶能够完全替换全能核酸酶,且去除HCD效率更高;
伦敦大学学院(UCL)的工艺开发团队,在细胞药物Car-T涉及的慢病毒(Lentivirus,LV)生产过程中,比较了Benzonase和M-SAN HQ中盐核酸酶在酶活、酶切时间、各阶段LV的稳定性等方面的表现,发现在生理盐条件下M-SAN HQ中盐核酸酶酶活更高、酶切时间更短,同时用纳米颗粒分析(NTA)技术确认M-SAN HQ组得到的LV病毒颗粒聚集更少、稳定性更高。他们会继续探究HCD是否影响LV的稳定性,及对LV侵染效率和生命周期是否有影响。通过更多研究,我们探究M-SAN HQ中盐核酸酶助力LV生产的关键机制。US FDA指南要求:重组biologics终产品中,核酸杂质含量低于10ng/dose。浙江生理盐条件中盐核酸酶70950-160
M-SAN HQ中盐核酸酶用在生产工艺流程中,在生理盐条件下去除双链及单链的DNA及RNA。浙江ArcticZymes中盐核酸酶
在传统生物技术行业(如抗体、疫苗领域)使用的下游纯化工艺步骤,已经用于慢病毒的大规模下游处理。主要是基于膜(过滤/澄清,利用切向流过滤TFF进行浓缩/渗滤,基于膜的色谱)和色谱(离子交换色谱IEC,亲和色谱AC,体积排阻色谱SEC)的技术。这些不同的过程步骤的组合是可变的,在某些情况下,不同的纯化方法可以用于相同的目的。此外,采用benzonase/M-SAN HQ中盐核酸酶降解污染的DNA或者用于下游的一个步骤,或者用于病毒生产阶段。浙江ArcticZymes中盐核酸酶
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