杆状病毒表达载体体系Baculovirus/Sf9(Baculovirusexpression vector,BEV),是应用杆状病毒表达载体(BEV)系统infect昆虫细胞Sf9,是一种替代哺乳动物包装细胞系的生产方案。整个系统包含两种BEV,其中一个BEV携带两侧有ITRs的目的基因,另一BEV则携带rep/cap基因。这两种BEV同时infectSf9即可组装AAV。由于杆状病毒具有辅助功能,因此BEV系统与可以稳定表达rep的Sf9细胞相结合,可用于灵活的、高滴度的大规模载体生产。BEV体系安全性好,infection效率高,生产工艺较之sTT更易放大,有更高的体积生产率优势。在符合ISO13485:2016体系基础上,增加了cGMP相应要求。浙江上海倍笃生物高盐核酸酶70921-150
三种AAV载体的生产体系(三质粒瞬转体系、杆状病毒表达载体体系以及包装细胞体系) 中都会出现三种衣壳:完整衣壳(full capsid)、部分衣壳(partial capsid),和空衣壳(empty capsid)。其中完整衣壳包含正确的DNA序列,是人们所期待的产品;部分衣壳和空衣壳包含部分不包含目的基因,属于生产中的杂质,约占细胞生产的总AAV颗粒的50%-90%。空衣壳/部分衣壳有如下几种危害:1), 影响产品的纯度,2), 增加终产品的免疫原性,3), 与完整衣壳竞争infection细胞上的载体结合受体,抑制完整衣壳的转导,4),增加总体病毒载量。部分衣壳与空衣壳地存在严重地影响了AAV产品的安全性和有效性,因此监管机构强烈建议在整个生产过程中监控空/完整衣壳比(空壳率)。福建高盐条件高盐核酸酶70921-202SAN HQ高盐核酸酶能够使载体表面的DNA去除更彻底,得到的AAV病毒颗粒更稳定。
宿主细胞DNA(HCD)残留以染色质形式存在,其中有带负电荷的DNA、带正电荷及疏水区段的组蛋白,就像胶带一样能够吸附很多物质,包括各种杂蛋白、色谱填料、目的病毒颗粒。非特异吸附杂蛋白,会影响蛋白杂质(如HCP)等的去除;吸附到色谱填料上,会降低色谱分离纯化效率;吸附到目的病毒颗粒时,会影响目的产物的稳定性,从而降低目的产物的得率。因此,从生产工艺层面来讲,一定要去除HCD,从而能够简化工艺、提高目的产物的产量。
跟其他类型的核酸酶一样,SAN HQ高盐核酸酶和M-SAN HQ中盐核酸酶的灭活方法有很多,分为可逆灭活及不可逆灭活。金属离子螯合剂如EDTA会可逆抑制两者的活性,加入的EDTA浓度一般是溶液中Mg2+浓度的2倍左右即可完全抑制活性;后续补加过量的Mg2+即可恢复核酸酶活性。加热、还原剂(如DTT)、咪唑、甘油及表面活性剂(如高于15%浓度的Triton X-100、SDS、尿素等)等都可以使其不可逆失活。在生物工艺流程,需要结合上下游应用需要选择合适的方法去除或灭活核酸酶。在AAV生产过程中使用SAN HQ高盐核酸酶。
经典的慢病毒载体(LV)的生产工艺如下,——三质粒系统瞬时转染HEK293细胞系,转染24小时后LV由转染阳性细胞生产并排出到培养上清液中;收获上清培养液后,加入核酸酶去除HCD污染,通过澄清步骤去除大的细胞碎片等杂质;下游纯化步骤分离LV载体,纯化方法包括切向流过滤TFF、色谱纯化及超速离心;纯化后的LV病毒颗粒经过无菌过滤,更换到优化后的配方中,灌装并冷冻保存。每批Car-T生产时取对应量的LV病毒,切忌反复冻融,否则LV病毒会失活。SAN HQ用量是Benzonase用量的1/3-1/4,酶用量更少,成本更低、工艺更简单。河南上海倍笃生物高盐核酸酶70921-150
SAN HQ高盐核酸酶在盐浓度400-650mM条件下活性达到峰值。浙江上海倍笃生物高盐核酸酶70921-150
细胞基因药物的基因递送有病毒及非病毒两种方式,其中病毒递送更为常用。在病毒递送路径中,腺相关病毒(AAV)和慢病毒(Lentivirus)是常用的两种载体;差别是病毒基因组的存在形式,AAV的基因组一般不整合到染色体中,以游离形式存在于染色体之外,且一般会表达数年之久;而慢病毒的基因组则会整合到染色体达到长期持续表达的目的。此外,其它用于基因药物的病毒载体有单纯疱疹病毒(HSV)、痘苗病毒(Vaccina Virus)、痘病毒(Poxviruses)。浙江上海倍笃生物高盐核酸酶70921-150
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