盐城分子生物学荧光定量PCR

Real-time PCR探针法适用于：1、具有高适应性和可靠性，实验结果稳定重複性好，特异性更高。2、适用于扩增序列专一的体系的检测。3、样品中靶基因含量过低的定量PCR检测。4、靶基因的特异序列较短，无论怎样较佳化引物设计条件都不能解决。5、存在与靶基因同源的序列，在PCR中容易出现非特异性扩增，对特异性要求较高的定量。6、普遍用于人类传染病的诊断和病原定量,在动物病原体基因的检测,畜禽产品的检验检疫,生物製品的鉴定。Real-time PCR探针法:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的萤光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告萤光基团和一个淬灭萤光基团。探针完整时，报告基团发射的萤光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告萤光基团和淬灭萤光基团分离，从而萤光监测系统可接收到萤光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个萤光分子形成，实现了萤光信号的累积与PCR产物形成完全同步。Real-time PCR反应的一个主要限制是，为了产生其选择性扩增的引物，需要目标序列的先前信息。盐城分子生物学荧光定量PCR

Real-time PCR原理：基于探针的化学法，Real-time PCR应用一个或多个荧光标记的寡核苷酸探针检测PCR扩增产物；依赖荧光能量共振传递（FRET）检测特异性扩增产物，单单检测特异性扩增产物，DNA及RNA定量；基因表达验证；等位基因鉴别；SNP分型；病原体和病毒检测；多重PCR，探针和目标片段的特异性结合产生荧光信号，因此减少了背景荧光和假阳性；探针可标记不同波长的荧光基团，用于多重PCR反应。对于不同的靶序列需要合成不同的探针，原料成本较高。盐城分子生物学荧光定量PCRReal-time PCR探针法普遍用于人类传染病的诊断和病原定量。

聚合酶链式反应：因为PCR扩增了目的DNA区域，所以PCR可以用于分析极少量的样品。这对于法医检定法，当时只有微量的DNA可作为证据。聚合酶链反应也可用于分析古代DNA那已经有数万年的历史了。这些基于聚合酶链反应的技术已经成功地应用于动物身上，例如四万年前猛犸，以及人类DNA，定量聚合酶链反应或者实时聚合酶链反应不要与逆转录-聚合酶链反应方法混淆)允许估计样品中存在的给定序列的量——这种技术通常用于定量确定基因表达的水平。定量PCR是一种已建立的DNA定量工具，用于测量每轮PCR扩增后DNA产物的积累。聚合酶链反应的试剂应分配到一次性的等分试样中。

引物的设计对于这个实验至关重要，因为Real-time PCR的检测灵敏度比较高，所以相应的对引物设计的要求就很高。普通的要求规则大家都知道，还有几点必须注意：1，引物的错配率（引物错配形成引物二聚体，但是SYBR照样能嵌入进去，结果导致实验结果的误差很大，重复性也不好）。2，引物的特异性一定要高（不像常规PCR，引物同源性不高，只要两条产物的片段长度相差足够大，在电泳的时候能够区分开就可以。Real-time PCR只有在熔解曲线的时候能分开，所以这就造成整个实验结果误差很大，不可信）。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同。

聚合酶链式反应生物学研究的历史中占据了重要的地位。以此为基础发展出包括Real-time PCR在内的多项应用技术。自诞生后Real-time PCR技术持续发展，从简单的增扩到整个PCR过程，Real-time PCR表现出比PCR更敏感、更明确的定量分析特性和对识别等位基因的能力。不少人以为real-time就是意味着可以在显示器上看到每个循环增扩曲线的增长。事实并非如此，早期的软件不能在运行期间提供可视化的增扩曲线。主要是因为SDS软件采用整个平台较终的数据执行数据分析工作，而不是分析每个单独的反应循环。对某些设备来说，必须向分析软件提供实时的数据，有些设备则不需要。前一种设备允许软件实时跟踪每个加样口的增扩曲线，同时显示在电脑屏幕上。实时荧光定量PCR是目前确定样品中DNA(或cDNA)拷贝数较敏感、较准确的方法。南京分子生物学定量PCR方案

实时荧光定量PCR通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。盐城分子生物学荧光定量PCR

Real-time PCR链式反应的特点：灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（μg=-6）水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位）；在细菌学中很小检出率为3个细菌。简便、快速：PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。武汉微量Real-time PCR供应商聚合酶链反应的试剂应分配到一次性的等分试样中。盐城分子生物学荧光定量PCR

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