福建RIP环状RNA实时定量PCR

3.2RNApull-down+MS/WB/qPCR/RNA-Seq设计目标RNA生物探针把相应的结合蛋白质与RNA复合物沉淀下来，蛋白质谱检测或WB检测与RNA结合的蛋白。设计目标RNA生物探针把相应的结合蛋白质与RNA复合物沉淀下来，qPCR检测或RNA-seq检测与RNA结合的RNA。3.3双荧光素酶报告实验双荧光素酶报告实验检测两个基因之间的互作。3.4病毒液以及siRNA设计提供circRNA过表达以及干扰慢病毒，腺病毒以及设计siRNA。四、CircRNA修饰研究4.1m6A/m5C/ac4C/m7G/m1A等修饰针对环状RNA各类修饰进行高通量筛选。4.2MeRIP-circRNA-PCR验证对高通量测序的结果，通过qPCR进行进一步验证。circRNA分子呈封闭环状结构，不易被核酸外切酶RNaseR降解，比线性RNA更稳定。福建RIP环状RNA实时定量PCR

2.环状RNA定量PCR及RNaseR耐受实验，验证环状RNA的表达和结构为了验证测序结果的准确性，研究人员随机选取了8条差异表达的环状RNA，利用“divergentprimers”进行环状RNA定量PCR检测和RNaseR耐受性实验。所有环状RNA的表达都能够被定量PCR实验检测到，并且定量PCR结果与测序结果趋势一致，表明环状RNA测序结果准确性非常高。所有环状RNA都能抵抗RNaseR的消化，进一步证实了这些RNA的环形结构。云序生物作为国内早期提供环状RNA测序的测序公司，自行建立的环状RNA数据库circDB，借物种覆盖广、数据量大、疾病背景多的特点为客户提供好的服务。黑龙江甲基化环状m6A是真核生物mRNA上常见的一种转录后修饰。

环状RNA作为研究持续火热的明星分子，不同于对其丰富的表达谱研究，环状RNA功能机制研究还处在起步阶段。环状RNA研究多为miRNA海绵机制，部分circRNA可竞争性结合miRNA，解除miRNA对靶基因的抑制作用，上调靶基因的表达。其实，环状RNA可以通过结合不同种类的功能蛋白，分别在转录前、后及翻译水平严格调控细胞生殖生长等过程。云序曾对环状RNA经典研究思路进行过详细解析（2018国自然研究热点一环状RNA研究深度剖析），感兴趣的老师可以查询浏览。

研究三：环状RNA分子功能机制 在确定Cia-cGAS具有明显细胞表型之后，作者围绕其分子机制展开了详细的探索。为了找到Cia-cGAS影响下游的靶基因，作者在敲除Cia-cGAS后进行转录组分析，发现差异表达的基因与IFN-α下游靶基因是一致的。且当Cia-cGAS敲除后I型IFN mRNAs 表达量也明显增高。结果，作者证实cia-cGAS通过调控I型IFN通路影响LT-HSC静息状态。接下来，作者针对Cia-cGAS在该通路中的作用机理进行了详细解析。作者直接采用RNA Pull Down技术手段找到与Cia-cGAS相互作用的功能蛋白。基于这一技术手段，作者发现Cia-cGAS与cGAS蛋白具有明显相互作用。cGAS RIP实验反向证实二者之间具有真实的相互作用。免疫荧光及FISH实验证实Cia-cGAS及cGAS细胞内共定位表达。基于EMSA等技术手段，作者找到了二者相互作用位点。后续作者补充大量生理生化实验，结果揭示LT-HSC中Cia-cGAS结合并抑制cGAS的活性，结果通过拮抗cGAS催化产物I型IFN来维持HSCs静息状态。同一基因位置可以产生不同类型的环状RNA。

云序生物对ac4CRNA乙酰化检测手段为acRIP-Seq技术，技术原理如下：将乙酰化RNA特异性抗体与被随机打断的RNA的片段进行共孵育，抓取有乙酰化修饰的片段进行测序；同时需要平行测序一个对照（Input）样本，对照样本只含有打断的RNA的片段，并不添加RNA乙酰化特异性抗体与其共孵育。对照样本用于消除非特异性抓取的乙酰化片段的背景。对比免疫共沉淀（IP）样本和对照样本（Input）中的序列片段，将RNA乙酰化修饰位点定位到转录组上，并根据RNA-seq数据，计算样本中RNA乙酰化程度及对RNA表达水平的影响。circRNA形成没有3’末端和5’末端的共价环状结构。天津m6a环状研究

与mRNA相比，m6A甲基化修饰在环状RNA上更普遍。福建RIP环状RNA实时定量PCR

研究背景：造血干细胞（HSC）自我更新和分化之间的平衡打破将导致骨髓衰竭及恶性血液tumour发生。然而，HSCs如何维持其静止状态并避免I型干扰素（IFN）介导能量耗竭、细胞凋亡仍未可知。本文一种名为cia-cGAS的环状RNA，它在长效（LT）-HSCs细胞核中高度表达。小鼠Cia-cGAS缺陷将导致I型IFN在骨髓中高表达并伴随静息LT-HSC数量明显减少。在稳态条件下，cia-cGAS在细胞核中通过结合DNA传感器cGAS以阻断其合酶活性，由此保护静息LT-HSC免于被cGAS介导耗尽凋亡。此外，cia-cGAS与线性cGAS相比，与cGAS结合亲和力更强，由此抑制cGAS介导LT-HSCs中I型IFN产生。本文揭示了一个新型环状RNA——cia-cGAS可结合DNA敏感的cGAMP合酶cGAS并抑制其活性，调控长效造血干细胞（LT-HSC）静息状态。福建RIP环状RNA实时定量PCR

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