Flip-Tip翻转技术、将一定密度的细胞悬液灌注在玻璃电极中,下降到电极前列的单个细胞通过在电极外施加负压可以与玻璃电极前列形成稳定的高阻封接,打破露在玻璃电极前列开口外的细胞膜就形成了全细胞记录模式。德国Flyion公司的Flyscreen8500系统采用的就是这一技术,其通量比较高为6,即一次可同时记录6个细胞。它的***特点是∶(1)仍然采用玻璃毛坯作为电极(2)药物施加微量、快速。SealChip技术;完全摒弃了玻璃电极,而是采用SealChip平面电极芯片一定密度的细胞悬液灌注在芯片上面,随机下降到芯片上约1-2μm的孔上并在自动负压的吸引下形成高阻封接,打破孔下面的细胞膜形成全细胞记录模式。采用这一技术的美国Axon(MDS)公司的PatchXpress7000A系统是高通量全自动膜片钳技术的典范,是离子通道药物研发的**性工具,在国外实验室和制药厂***用于hERG通道药理学的研究。其通量比较高为16,即一次可同时记录16个细胞同时,其药物施加微量、快速,不仅用于药物筛选,还大量用于离子通道的基础研究。脂质层电导很低,由于双分子层的结构特点,形成了细胞的膜电容,通道蛋白开闭状况主要决定了膜电导的数值。美国脑片膜片钳价格
全细胞膜片钳记录(whole-cellpatch-clamprecording)是应用*早,也是*广的钳位技术,它相当于连续的单电极电压钳位记录,也就是说全细胞记录类似于传统的细胞内记录,但它具有更大的优越性,如高分辨率、低噪声、极好的稳定性以及能控制细胞内的成分等。全细胞记录技采测定的是一个细胞内全部**通道的电流,记录过程中电极的溶液取代了原细胞质的成分。虽然膜片钳记录技术与*初的单电极电压钳位相比进步了很多,尤其在单离子通道钳位记录方面,细胞或脑片的组织选择及实验溶液的制备仍然是很重要的步骤。美国单电极膜片钳专题了解离子通道的功能以及结构的关系对于从分子水平深入探讨某些疾病措施等均具有十分重要的理论和实际意义。
膜片钳技术发展历史:1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时,记录到ACh启动的单通道离子电流,从而产生了膜片钳技术。1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50cmH2O的负压吸引,得到10-100GΩ的高阻封接(Giga-seal),明显降低了记录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进,引进了膜片游离技术和全细胞记录技术,从而使该技术更趋完善,具有1pA的电流灵敏度、1μm的空间分辨率和10μs的时间分辨率。1983年10月,《Single-ChannelRecording》一书问世,奠定了膜片钳技术的里程碑。Sakmann和Neher也因其杰出的工作和突出贡献,荣获1991年诺贝尔医学和生理学奖。
膜片钳技术本质上也属于电压钳范畴,两者的区别关键在于:①膜电位固定的方法不同;②电位固定的细胞膜面积不同,进而所研究的离子通道数目不同。电压钳技术主要是通过保持细胞跨膜电位不变,并迅速控制其数值,以观察在不同膜电位条件下膜电流情况。因此只能用来研究整个细胞膜或一大块细胞膜上所有离子通道活动。目前电压钳主要用于巨大细胞的全性能电流的研究,特别在分子克隆的卵母细胞表达电流的鉴定中发挥着其他技术不能替代的作用。该技术的主要缺陷是必须在细胞内插入两个电极,对细胞损伤很大,在小细胞如元,就难以实现,又因细胞形态复杂,很难保持细胞膜各处生物特性的一致。浸溶细胞溶液和微电极玻璃管内的填充液成分对全细胞膜片钳记录也是很重要的内容。
高阻封接技术还明显降低了电流记录的背景噪声,从而戏剧性地提高了时间、空间及电流分辨率,如时间分辨率可达10μs、空间分辨率可达1平方微米及电流分辨率可达10-12A。影响电流记录分辨率的背景噪声除了来自于膜片钳放大器本身外,主要还是信号源的热噪声。信号源如同一个简单的电阻,其热噪声为σn=4Kt△f/R式中σn为电流的均方差根,K为波尔兹曼常数,t为温度,△f为测量带宽,R为电阻值。可见,要得到低噪声的电流记录,信号源的内阻必需非常高。如在1kHz带宽,10%精度的条件下,记录1pA的电流,信号源内阻应为2GΩ以上。电压钳技术只能测量内阻通常达100kΩ~50MΩ的大细胞的电流,从而不能用常规的技术和制备达到所要求的分辨率。玻璃微电极的应用使的电生理研究进行了重命性的变化。日本全细胞膜片钳研究
对离子通道功能的研究,主要采用记录离子通道电流来间接反映离子通道功能。美国脑片膜片钳价格
膜片钳技术原理:膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来(见右图),由于电极前列与细胞膜的高阻封接,在电极前列笼罩下的那片膜事实上与膜的其他部分从电学上隔离,因此,此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管,用一个极为敏感的电流监视器(膜片钳放大器)测量此电流强度,就单一离子通道电流膜片钳技术的建立,对生物学科学特别是神经科学是一资有重大意义的变革。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的(或多个的离子通道分子活动的技术。些技术的出现自然将细胞水平和分子水平的生理学研究联系在一起,同时又将神经科学的不同分野必然地融汇在一起,改变了既往各个分野互不联系、互不渗透,阻碍人们较全认识能力的弊端。这一技术的发现和基因克隆技术并架齐驱,给生命科学研究带来了巨大的前进动力。美国脑片膜片钳价格
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