电压钳技术,是20世纪初由Cole发明,Hodgkin和Huxley完善,其设计的主要目的是为了证明动作电位的产生机制,即动作电位的峰电位是由于膜对钠的通透性发生了一过性的增大过程。但当时没有直接测定膜通透性的方法,于是就用膜对某种离子的电导来**该种离子的通透性,膜电导测定的依据是电学中的欧姆定律,如膜的Na电导GNa与电化学驱动力(Em-ENa)和膜电流INa的关系GNa=INa/(Em-ENa).因此可通过测量膜电流,再利用欧姆定律来计算膜电导,但是,利用膜电流来计算膜电导时,记录膜电流期间的膜电位必须保持不变,否则膜电流的变化就不能**膜电导的变化。这一条件是利用电压钳技术实现的。下张幻灯中的右边两张图是Hodgkin和Huxley在半个世纪以前利用电压钳记录的抢乌贼的动作电位和动作电位过程中的膜电流的变化图,他们的实验***证明参与动作电位的离子流由Na,k,漏(Cl)三种成分组成。并对这些离子流进行了定量分析。这一技术对阐明动作电位的本质和离子通道的的研究做出了极大的贡献。典型的单通道电流呈一种振幅相同而持续时间不等的脉冲样变化。美国单电极膜片钳参数
膜片钳技术发展至今,已经成为现代细胞电生理的常规方法,它不仅可以作为基础生物医学研究的工具,而且直接或间接为临床医学研究服务。目前膜片钳技术广泛应用于神经(脑)科学、心血管科学、药理学、细胞生物学、病理生理学、中医药学、植物细胞生理学、运动生理等多学科领域研究。随着全自动膜片钳技术(Automaticpatchclamptechnology)的出现,膜片钳技术因其具有的自动化、高通量特性,在药物研发、药物筛选中显示了强劲的生命力。细胞膜片钳参数封接(seal)是膜片钳记录的关键步骤之一。
实验溶液浸溶细胞溶液和微电极玻璃管内的填充液成分对全细胞膜片钳记录也是很重要的内容,这关系到封接的容易程度、细胞存活状态及膜电位的状态等。在实验记录过程中,尤其是神经生物学实验,需要迅速更换细胞浸溶液浓度以免受体敏感性降低(desensitization)或需要模拟快速突触反应的寿命。原则上细胞的浸溶液成分或玻璃管内填充液成分应该与细胞外或细胞内间质的成分相似,实际研究中,为了探讨某些通道或电位特性,对这些实验溶液的成分或浓度会作必要调整,没有哪种溶液是理想的。
膜片钳的基本原理则是利用负反馈电子线路,将微电极前列所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜的电位固定在一定水平上,对通过通道的微小离子电流作动态或静态观察,从而研究其功能。膜片钳技术实现膜电流固定的关键步骤是在玻璃微电极前列边缘与细胞膜之间形成高阻密封,其阻抗数值可达10~100GΩ(此密封电阻是指微电极内与细胞外液之间的电阻)。由于此阻值如此之高,故基本上可看成绝缘,其上之电流可看成零,形成高阻密封的力主要有氢健、范德华力、盐键等。此密封不仅电学上近乎绝缘,在机械上也是较牢固的。又由于玻璃微电极前列管径很小,其下膜面积只约1μm2,在这么小的面积上离子通道数量很少,一般只有一个或几个通道,经这一个或几个通道流出的离子数量相对于整个细胞来讲很少,可以忽略,也就是说电极下的离子电流对整个细胞的静息电位的影响可以忽略,那么,只要保持电极内电位不变,则电极下的一小片细胞膜两侧的电位差就不变,从而实现电位固定。膜电导测定的依据是电学中的欧姆定律。
膜片钳技术原理:膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来(见右图),由于电极前列与细胞膜的高阻封接,在电极前列笼罩下的那片膜事实上与膜的其他部分从电学上隔离,因此,此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管,用一个极为敏感的电流监视器(膜片钳放大器)测量此电流强度,就单一离子通道电流膜片钳技术的建立,对生物学科学特别是神经科学是一资有重大意义的变革。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的(或多个的离子通道分子活动的技术。些技术的出现自然将细胞水平和分子水平的生理学研究联系在一起,同时又将神经科学的不同分野必然地融汇在一起,改变了既往各个分野互不联系、互不渗透,阻碍人们较全认识能力的弊端。这一技术的发现和基因克隆技术并架齐驱,给生命科学研究带来了巨大的前进动力。膜片钳技术原理膜片钳技术是用玻璃微电极接触细胞,形成吉欧姆(GΩ)阻抗。美国单电极膜片钳参数
对离子通道功能的研究,主要采用记录离子通道电流来间接反映离子通道功能。美国单电极膜片钳参数
全细胞记录构型(whole-cellrecording) 高阻封接形成后,继续以负压抽吸使电极管内细胞膜破裂,电极胞内液直接相通,而与浴槽液绝缘,这种形式称为“全细胞”记录。它既可记录膜电位又可记录膜电流。其中膜电位可在电流钳情况下记录,或将玻管连到标准高阻微电极放大器上记录。在电压钳条件下记录到的大细胞全细胞电流可达nA级,全细胞钳的串联电阻(玻管和细胞内部之间的电阻)应当补偿。任何流经膜的电流均流经这一电阻,所引起的电压降将使玻管电压不同于细胞内的真正电位。电流愈大,愈需对串联电阻进行补偿。全细胞钳应注意细胞必需合理的小到其电流能被放大器测到的范围(25~50nA)。减少串联电阻的方法是玻管尖要比单通道记录大。美国单电极膜片钳参数
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