双光子显微镜是结合了双光子激发技术和激光扫描共聚显微镜的一种新型荧光显微镜，其原理大致是这样的：首先，让我们来看看什么是荧光显微镜。荧光显微镜是以紫外线为光源，照射被检物体上的荧光物质或是荧光染料，使其发出荧光。相比普通光学显微镜，荧光显微镜运用了波长更短的紫外线，再将可见光过滤掉，提高了分辨力率。而当被检物体过厚时，从不同深度发出的荧光都会打在物镜上，使观察到的像模糊、发虚，无法清楚的知道被检物体的结构。而激光扫描共聚显微镜就是在荧光显微镜的基础上，增加了激光扫描装置，从而解决了上述问题。激光共聚扫描显微镜脱离了传统光学显微镜的场光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源，激光束经照明孔，经由分光镜反射至物镜，并聚焦于样品上，对标本焦平面上每一点进行扫描。组织样品中的荧光物质受到刺激后发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜，通过探测孔时先聚焦，然后被光探头收集，转化为信号输送到计算机进行处理。这个装置能让通过探测***的只有焦平面上发出的荧光，使成像更为清晰准确，同时通过改变物镜的焦距，能对不同焦平面进行扫描，通过计算机绘出普通显微镜无法观测的三维图像。双光子显微镜在各领域研究中已有许多成功实例。国外investigator双光子显微镜价位
研究人员通过用不同激光波长并行化激光扫描（wavelengthmultiplexing），增加了相同时间内可以成像的体积，并同时保持较高的时间和空间分辨率。通过引入两种波长不同的钙信号荧光探针，研究人员将神经元群体的活动标记为两个不同颜色，并同时用两个不同波长的激光激发探针，实现了两个颜色的并行化数据记录。为了实现三维空间成像，研究人员还分别在两个激光光路上配置了快速变焦系统，分别为电可调节透镜（electricaltunablelens）和空间光调制器（spatiallightmodulator）。由此，可以同时以10赫兹的速度记录500微米500微米的10个平面，覆盖纵深达600微米，涵盖了从脑皮层第2层到第5层的结构，体积内记录到的神经元可以达到2000个以上。进口ultima2PPLUS双光子显微镜光子跃迁双光子显微镜大量运营在实验室当中；
双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双（多）光子成像优势在于，具有更深的组织穿透深度，利用红外光，能够在层面检测极限达1mm的组织区域；因信号背景比高，而具有更高的对比度；因激发体积小，具有定点激发的特性，具有更少的光毒性；激发波长由紫外、可见光调整为红外激发，能够更加安全。
配合双光子激发技术，激光共聚扫描显微镜则能更好得发挥功效。那么，什么是双光子激发技术呢？在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子使电子跃迁到较高能级，经过一个很短的时间后，电子再跃迁回低能级同时放出一个波长为长波长一半的光子（P=h/λ）。利用这个原理，便诞生了双光子激发技术。双光子显微镜使用长波长脉冲激光，通过物镜汇聚，由于双光子激发需要很高的光子密度，而物镜焦点处的光子密度是比较高的，所以只有在焦点处才能发生双光子激发，产生荧光，该点产生的荧光再穿过物镜，被光探头接收，从而达到逐点扫描的效果。如果已经有了飞秒光，就可以几套双光子显微镜共享一台，只需分光即可。
从双光子的原理和特点我们就可以明显的得出双光子的优点：☆光损伤小：由于双光子显微镜使用的是可见光或近红外光作为激发光源，这一波段的光对细胞和组织的光损伤小，适用于长时间的研究；☆穿透能力强：相对于紫外光，可见光和近红外光都具有更强的穿透能力，因而受生物组织散射的影响更小，解决对生物组织中深层物质的层析成像研究问题；☆高分辨率：由于双光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的区域内可以激发出荧光，双光子吸收局限于焦点处的体积约为波长3次方的范围内；☆漂白区域小：由于激发只存在于交点处，所以焦点以外的区域都不会发生光漂白现象；☆荧光收集率高：与共聚焦成像相比，双光子成像不需要光学滤波器（共焦），这样就提高了对荧光的收集率，而收集率的提高直接导致图像对比度的提高；☆图像对比度高：由于荧光波长小于入射波长，因而瑞利散射产生的背景噪声只有单光子激发时的1/16，降低了散射的干扰；☆光子跃迁具有很强的选择激发性，所以可以对生物组织中一些特殊物质进行成像研究；双光子显微镜除了可以进行厚的组织样品拍摄以外呢，可以在小鼠的的任何部位进行成像。美国激光双光子显微镜原理
双光子显微镜只有焦平面处才能形成双光子吸收，而焦平面之外由于光强低无法被发动，所以双光子成像更清晰。国外investigator双光子显微镜价位
在该自适应光学双光子荧光显微镜中，她们将空间光位相调制器光学共轭到显微物镜的后焦平面，通过位相调制器将入射光分成若干子区域，每一块子区域的波前都可以被控制。同时，她们用数字微阵列光处理器，以不同的频率同时调制其中一半子区域的入射光强度，以另一半子区域作为“参考波前”。来自所有子区域光束会在焦点处会聚干涉，通过监测焦点激发的双光子信号随时间的变化情况，并进行傅里叶变换分析，可以“分解”得到被调制的每一块子区域的“光线”的贡献信息，从而可以实现对一半子区域波前的并行测量。对另一半子区域重复这一测量过程，从而获得整个入射波前的信息并进行校正。该方法耗时很短，通常约1~3分钟左右即可完成像差的测量和校正，无需复杂的计算，适用于任何标记密度和标记类型的样品。更重要的是，得到的像差校正图案可以用于提高较大视场范围内的成像质量。该方法无疑为在体研究小鼠大脑皮层深层区域的生物、医学问题提供了可行性方案。国外investigator双光子显微镜价位
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