双光子显微镜的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有 100 飞秒，而其周期可以达到 80至100兆赫兹。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是比较高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦***，提高了荧光检测效率。双光子显微镜有哪些分类呢？激光荧光双光子显微镜代理商
双光子吸收理论早在1931年就由诺奖得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因为有了激光才得到实验验证，但是到WinfriedDenk发明双光子显微镜又用了将近30年。要理解双光子的技术挑战和飞秒激光发挥的重要作用，首先要了解其中的非线性过程。双光子吸收相当于和频产生非线性过程，这要求极高的电场强度，而电场取决于聚焦光斑大小和激光脉宽。聚焦光斑越小，脉宽越窄，双光子吸收效率越高。对于衍射极限显微镜，聚焦在样品上的光斑大小只和物镜NA和激光波长有关，所以关键变量只剩下激光脉宽。基于以上分析，能够以高重频(100MHz)输出超短脉冲(100fs量级)的飞秒激光器成了双光子显微镜的标准激发光源。这也再次说明双光子显微镜的优势：只有焦平面处才能形成双光子吸收，而焦平面之外由于光强低无法被激发，所以双光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飞秒激光器(100fs脉宽、630nm可见光波长)。虽然染料激光器对于实验室演示尚可，但是使用很不方便所以远未实现商用。很快双光子显微镜的标配光源就变成了飞秒钛宝石激光器。除了固态光源优势，钛宝石激光器还具有较宽的近红外波长调谐范围，而近红外相比可见光穿透更深，对生物样品损伤更小。国内investigator双光子显微镜荧光探测由于双光子显微镜使用的是可见光或近红外光作为激发光源，适用于长时间的研究。
激光共聚扫描显微镜脱离了传统光学显微镜的场光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源，激光束经照明，经由分光镜反射至物镜，并聚焦于样品上，对标本焦平面上每一点进行扫描。组织样品中的荧光物质受到刺激后发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜，通过探测时先聚焦，然后被光探头收集，转化为信号输送到计算机进行处理。这个装置能让通过探测的只有焦平面上发出的荧光，使成像更为清晰准确，同时通过改变物镜的焦距，能对不同焦平面进行扫描，通过计算机绘出普通显微镜无法观测的三维图像。而配合了双光子激发技术，激光共聚扫描显微镜则能更好得发挥功效。那么，什么是双光子激发技术呢？在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子使电子跃迁到较高能级，经过一个很短的时间后，电子再跃迁回低能级同时放出一个波长为长波长一半的光子（P=h/λ）。利用这个原理，便诞生了双光子激发技术。
由于具有较高输出功率的光源可以提高成像速度，在我们的实验中，时间分辨率主要是受OPO输出可见光激光功率的限制。尽管在单点扫描系统中，v2PE激发会使得空间分辨率提高，但多聚焦v2PE显微镜具有与1PE多聚焦显微镜近乎相同的横向分辨率，这主要是多聚焦成像和单点扫描技术之间的差异造成的。由于v2PE的激发体积小于1PE，引入图像扫描技术可以进一步提高空间分辨率，这种技术需要通过在阵列前引入额外的微透镜阵列来实现。除此之外，由于可见光区域的共振效应，可能会产生光漂白，因而为了延长观察时间，系统还需要对激发强度和曝光时间做进一步优化。这种双光子显微镜的视场是普通显微镜的10倍。
其实电子显微镜相比于光学显微镜的重要优势或者存在的比较大意义，准确的来说，不在于放大倍数，而在于超高的分辨率。这两者是不同的。通俗的来说，就是进行观察的时候，除了要将物体放大，还需要能将它与相邻的其他物体分辨开来。如果两个相邻微粒的图像在光学显微镜下，即使放大到很大，看到的可能却是两个相交的亮斑（艾里斑），而没有明显的界限（更不用说细节了），这表示是分辨率不够。抛开分辨率谈放大倍数是没有意义的。光学显微镜的分辨率极限是阿贝极限，约等于光波波长的一半，通常被说成是光学显微镜放大极限，其实准确地来说，应该叫做分辨率的极限。而其产生的原因是光的衍射，根本原因是光的波粒二象性。电子衍射实验证明了电子的波动性，于是用电子代替光的电子显微镜成为可能。电子显微镜也有多种，题主说的是像REM的。电镜也存在用衍射规则观察的，比如低能电子衍射（LEED）和透射电镜（TEM）。两者主要用于观察晶体，根据其周期性的特点而生成倒易空间里的衍射图像，借助elward球或者傅里叶变换就可以转换到实空间，得到真正的晶体表面图像了。优势来源于其双光子光源的非线性光学效应。国外2PPLUS双光子显微镜光毒性
双光子显微镜为什么穿透能力强?激光荧光双光子显微镜代理商
双光子显微镜是结合了双光子激发技术和激光扫描共聚显微镜的一种新型荧光显微镜，其原理大致是这样的：首先，让我们来看看什么是荧光显微镜。荧光显微镜是以紫外线为光源，照射被检物体上的荧光物质或是荧光染料，使其发出荧光。相比普通光学显微镜，荧光显微镜运用了波长更短的紫外线，再将可见光过滤掉，提高了分辨力率。而当被检物体过厚时，从不同深度发出的荧光都会打在物镜上，使观察到的像模糊、发虚，无法清楚的知道被检物体的结构。而激光扫描共聚显微镜就是在荧光显微镜的基础上，增加了激光扫描装置，从而解决了上述问题。激光共聚扫描显微镜脱离了传统光学显微镜的场光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源，激光束经照明孔，经由分光镜反射至物镜，并聚焦于样品上，对标本焦平面上每一点进行扫描。组织样品中的荧光物质受到刺激后发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜，通过探测孔时先聚焦，然后被光探头收集，转化为信号输送到计算机进行处理。这个装置能让通过探测***的只有焦平面上发出的荧光，使成像更为清晰准确，同时通过改变物镜的焦距，能对不同焦平面进行扫描，通过计算机绘出普通显微镜无法观测的三维图像。激光荧光双光子显微镜代理商
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